• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文学位 >C/EBPα表达异常及编码基因突变在急性髓系白血病耐药及免疫逃逸中的作用研究
【6h】

C/EBPα表达异常及编码基因突变在急性髓系白血病耐药及免疫逃逸中的作用研究

代理获取
页面导航
  • 目录
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

目录

声明

致谢

前言

摘要

缩略语

1．C／EBPα表达异常在APL细胞分化阻滞及ATRA耐用中的作用研究

1．1．引言

1．2．材料和方法

1．3．实验结果

1．4．讨论

1．5．小结

2．CEBPA基因突变在AML细胞选逸NKG2D介导的免疫杀伤中的作用研究

2．1．引言

2．2．材料和方法

2．3．实验结果

2．4．讨论

2．5．小结

结论

参考文献

综述

作者简历及在学期间主要成果

展开▼

摘要

本文分以下两个章节进行探讨：
　　第1章 C/EBPα表达异常在APL细胞分化阻滞及ATRA耐用中的作用研究
　　背景：CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein alpha，C/EBPα)是髓系分化过程的重要调控因子，对造血细胞的分化命运起决定作用。C/EBPα表达减低引起的髓系分化阻滞参与了M3型（即APL）、AML1-ETO阳性的M2型及CBFB-MYH11阳性的M4型等类型的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)的发生。我们通过蛋白免疫印迹技术发现在全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid，ATRA)耐药的APL细胞中与ATRA敏感的APL细胞中C/EBPα蛋白的表达水平有明显差异。C/EBPα蛋白表达异常在APL细胞耐药中的作用国内外未有研究，有望成为耐药的APL治疗的新靶点。
　　目的：本部分旨在研究C/EBPα蛋白在ATRA耐药的APL细胞中异常表达的原因，及其在APL细胞对ATRA耐药中的作用;研究恢复C/EBPα蛋白对耐药的APL细胞的诱导分化作用及对全反式维甲酸敏感性的恢复，为APL耐药及复发的预防和诱导缓解治疗提供思路。
　　方法：本部分通过蛋白免疫印迹技术检测ATRA耐药株及敏感株中C/EBPα蛋白42KDa及30KDa形式的差异表达及相关通路活化水平;通过慢病毒表达载体pLenti-CEBPA-WT或pLenti-CEBPA-P30在ATRA耐药的APL细胞株NB4-R1中分别恢复42KDa及30KDa形式C/EBPα蛋白，以感染慢病毒空载体细胞作为对照，通过流式细胞术检测不同亚株的粒系分化抗原表达的改变，聚合酶链反应检测分化相关基因表达;不同细胞亚株经过ATRA处理，通过检测细胞分化及观察形态学改变检测细胞对ATRA的敏感性;利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(hi stonedeacetylase inhibitor, HDACi)曲古抑菌素A（TrichostatinA，TSA）处理NB4-R1细胞，western blot检测C/EBPα蛋白表达，并进行流式检测研究TSA与ATRA协同诱导NB4-R1分化作用，MTT比色法检测抑制细胞增殖的作用。
　　结果：在ATRA耐药的NB4-R1细胞中C/EBPα蛋白的表达水平明显低于NB4细胞，尤其以42KDa形式蛋白减低最为显著;PI3K/Akt/mTOR通路在NB4-R1细胞中活化减低，而翻译相关因子eIF2α在NB4-R1细胞中活化增高;通过PI3K抑制剂LY294002或mTOR抑制剂RAD001抑制NB4细胞中PI3K/Akt/mTOR通路时，C/EBPα蛋白表达随之降低;NB4-R1细胞中恢复42KDa C/EBPα蛋白表达可诱导粒单核细胞分化抗原CD11b及CD14表达，促进粒单核分化相关基因GM-CSFR的转录，并通过抑制PU.1基因的转录在粒单核分化选择时促进粒细胞的分化。NB4-R1中过表达42KDa C/EBPα蛋白还抑制了AML细胞增殖相关基因FLT3的转录。恢复NB4-R1细胞42KDa C/EBPα蛋白表达增强了细胞对ATRA诱导的细胞分化的敏感性，在1μM ATRA处理下CD11b的表达即有明显提升，细胞出现了终末分化的形态学改变;在NB4-R1细胞中过表达30KDa C/EBPα蛋白则不能诱导细胞分化，也不能恢复NB4-R1细胞对ATRA的敏感性;TSA处理NB4-R1细胞上调C/EBPα蛋白的表达，并与ATRA协同作用诱导细胞分化及抑制细胞增殖。
　　结论：PI3K/Akt/mTOR通路抑制及eIF2α过度激活导致NB4-R1细胞中C/EBPα蛋白表达异常，恢复NB4-R1细胞中42KDa C/EBPα蛋白表达可诱导细胞分化并恢复细胞对ATRA敏感性，恢复30KDa C/EBPα蛋白表达则不能恢复NB4-R1细胞的分化和ATRA的敏感性;利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA上调C/EBPα蛋白表达可与ATRA协同作用诱导APL耐药细胞分化及抑制细胞增殖。
　　第2章 CEBPA基因突变在AML细胞逃逸NKG2D介导的免疫杀伤中的作用研究
　　背景：自然杀伤细胞(nature killing cells，NK)的非特异性免疫杀伤作用在抗白血病免疫监视中占有重要地位，其中NK细胞表面的NKG2D受体对白血病细胞表面的配体的识别是NK细胞发挥杀伤功能的前题。白血病细胞中常见NKG2D配体表达的减低或缺失，使白血病细胞逃逸NK细胞的免疫杀伤作用，成为白血病发病急复发的来源。因此研究白血病细胞NKG2D配体表达的调节机制是增强抗白血病免疫首要解决的问题。转录因子CCAAT增强子结合蛋白alpha(CCAATenhancer binding protein alpha，C/EBPα)的编码基因CEBPA突变是导致白血病发病及复发的重要原因，我们通过转录组芯片分析发现CEBPA基因及其突变体对NKG2D配体UL-16结合蛋白（UL-16 binding proteins，ULBPs）的表达有不同的调节作用，是增强抗白血病免疫的潜在靶点。
　　目的：本部分旨在研究转录因子C/EBPα对NKG2D配体ULBPs表达的调节作用，及其编码基因CEBPA突变对NK细胞杀伤作用的敏感性的影响，揭示CEBPA基因突变在白血病细胞逃逸NKG2D介导的免疫监视中的作用，并为抗白血病免疫治疗和复发的预防提供理论基础。
　　方法：通过慢病毒感染不同类型细胞株，建立稳定表达C/EBPα蛋白野生型、三种不同类型突变体及截短的30KDa蛋白(P30)的细胞亚株。突变体分别为:N'端第一个转录激活结构域(transcription activation domain，TAD1)编码区移码突变(247dupC);N'端TAD2编码区重复突变(584-589dup);C'端碱性亮氨酸拉链结构域(basic leucinezipper motif，bZIP)重复突变(914-916dup)。通过流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测过表达C/EBPα野生型及不同类型突变体的AML细胞NKG2D配体的表达水平;过表达C/EBPα野生型及不同类型突变体的AML细胞与NK92MI细胞共培养，PI/CFSE双染法检测各亚株对NK细胞杀伤作用的敏感性，CD107a及CD56标记检测NK细胞脱颗粒水平;根据NCBI数据库序列信息利用Promoter Scan工具及SABiosciencesdatabase预测C/EBPα与ULBP1基因启动子区域的结合位点。
　　结果：不同类型的AML细胞株ULBPs的表达水平不同，使得各细胞株对NK92MI细胞杀伤作用的敏感性有显著差异;C/EBPα蛋白野生型在各类型ULBPs均不表达的NB4细胞中上调ULBPs的表达水平，增加NB4细胞对NK细胞杀伤的敏感性，但对主要组织相容性复合物Ⅰ类分子相关抗原A、B(Major histocompatibilitycomplex class I-related chain A/B，MICA/B)及HLA-Ⅰ类分子的表达水平无影响;C/EBPα蛋白TAD2结构域突变(NM2)保留了野生型蛋白对ULBPs的调节作用，过表达后仍可以增加NB4细胞对NK杀伤的敏感性;C/EBPαN'端TAD1结构域突变体(NM1)、C'端bZIP结构域突变体(CM)及P30失去上调ULBPs表达的功能，不能增加NB4细胞对NK92MI细胞的杀伤敏感性;颗粒酶途径参与了NK92MI细胞对过表达C/EBPα蛋白的NB4细胞的杀伤作用，与过表达C/EBPα蛋白野生型及NM2突变的白血病细胞共培养的NK92MI细胞脱颗粒水平明显增加;在内源性ULBP2/5/6表达较高的K562细胞中，C/EBPαNM1突变体、CM突变体及P30蛋白竞争性抑制野生型C/EBPα蛋白的功能，下调K562细胞中内源性ULBP2/5/6表达水平，并降低K562细胞对NK杀伤作用的敏感性。
　　结论：C/EBPα作为转录因子调节AML细胞中ULBPs的表达，促进NK细胞对白血病细胞的识别与杀伤。TAD1及bZIP结构域的完整性对C/EBPα调节ULBPs功能的行使至关重要。无TAD1结构域的C/EBPαP30蛋白、NM1及CM突变体均失去了对ULBPs转录的调节作用，并竞争性抑制野生型C/EBPα的功能，使AML细胞内源性ULBPs表达降低而逃逸NKG2D配体介导的免疫杀伤作用。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号