通过敲除TAP1及TAPBP基因产生低免疫原性的人类胚胎干细胞

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致谢

摘要

缩略词表

1．引言

1．1 人类胚胎干细胞的前景和问题

1．1．1 人类胚胎干细胞的应用前景

1．1．2 人类胚胎干细胞用于临床应用面临的问题

1．2 移植免疫排斥

1．2．1 MHC Ⅰ在移植免疫排斥中的作用

1．2．2 TAP1及TAPBP在MHC Ⅰ抗原递呈过程中的作用

1．3 诱导性多能干细胞(iPSCs)

1．4 基因打靶方法

1．4．1 同源重组方法

1．4．2 锌指核酸酶技术(ZFN)

1．4．3 转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术

1．4．4 CRISPR-Cas9技术

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞

2．1．2 菌株

2．1．3 质粒

2．1．4 试剂和试剂盒

2．1．5 抗体

2．1．6 主要实验仪器、设备

2．2 实验方法

2．2．1 分子克隆菌种生长相关培养基制备

2．2．2 感受态细菌的制备

2．2．3 质粒DNA及连接产物的转化

2．2．4 质粒DNA小量抽提

2．2．5 质粒DNA中量抽提

2．2．6 基因组抽提

2．2．7 F140 Kit裂解细胞，PCR

2．2．8 PCR产物纯化回收

2．2．9 细胞培养相关试剂的配制

2．2．10 人类胚胎干细胞系的培养

2．2．11 无饲养层的人类胚胎干细胞系的培养

2．2．12 TALENs设计及构建

2．2．13 在293T细胞上初步验证筛选活性TALENs质粒

2．2．14 活性TALENs质粒转染人类胚胎干细胞

2．2．15 人类胚胎细胞打靶效率的鉴定

2．2．16 流式细胞仪分析MHc Ⅰ在细胞表面的表达水平(FACS)

2．2．17 细胞免疫染色

2．2．18 RNA抽提

2．2．19 反转录RNA

2．2．20 实时定量PCR(real-time PCR)

2．2．21 畸胎瘤形成检测

2．2．22 免疫排斥反应分析

2．2．23 数据统计

3．实验结果

3．1 TAP1及TAPBP敲除人类胚胎干细胞系的建立

3．1．1 构建TAP1及TAPBP基因打靶的TALENs

3．1．2 TALENs质粒组合活性的鉴定

3．1．3 在人类胚胎干细胞中敲除TAP1及TAPBP基因

3．2 MHC Ⅰ分子在TAP1及TAPBP基因敲除细胞系中的表达情况

3．3 TAP1及TAPBP敲除人类胚胎干细胞系具有的多能性

3．3．1 TAP1及TAPBP敲除人类胚胎干细胞系的干性特异性标记的表达验证

3．3．2 TAP1及TAPBP基因敲除的人类胚胎干细胞分化能力及多能性的验证

3．3．3 TAP1及TAPBP基因敲除细胞系的核型检测

3．4 TAP1及TAPBP基因敲除人类胚胎干细胞系的免疫原性降低

4．讨论

5．小结

参考文献

作者简历

科研成果