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硫氧还蛋白和过氧还蛋白介导的油菜素内酯对番茄光合作用的调控及其在逆境胁迫响应中的生理和分子作用机理

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摘要

缩略词表

1 引言

1．1 油菜素内酯(BRs)对植物光合作用的调控

1．1．1 外源BRs对植物光合作用的调控

1．1．2 逆境条件下BRs对植物光合作用的调控

1．1．3 内源BRs水平对植物光合作用的影响

1．2 硫氧还蛋白(TRXs)概述

1．2．1 TRXs的分子和功能特点

1．2．2 TRXs的多样性

1．2．3 叶绿体TRXs的功能

1．3 过氧还蛋白(Prxs)在植物逆境响应中的调控

1．3．1 植物中Prxs的类型及作用机制

1．3．2 2-Cys Prx(2-CP)的功能特点及氧化还原调控

1．3．3 2-CP在非生物胁迫响应中的作用

1．4 自噬在植物逆境响应中的作用

1．4．1 自噬体形成的分子机制

1．4．2 自噬参与植物对生物胁迫的响应

1．4．3 自噬参与植物对非生物胁迫的响应

1．5 本文的研究目的和意义

2 番茄叶绿体TRXs及2-CP相关基因沉默植株的构建

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体构建和病毒侵染

2．1．3 总RNA提取和基因表达分析

2．2 结果与分析

2．2．1 TRX单基因沉默植株沉默效率验证

2．2．2 2-CP单基因及共沉默植株沉默效率验证

2．3 讨论

3 叶绿体TRXs参与调控植物光合电子传递

3．1 材料与方法

3．1．1 植物材料

3．1．2 叶绿素及类胡萝卜素含量测定

3．1．3 双通道叶绿素荧光及P700测定

3．1．4 环式电子传递的测定

3．1．5 NADPH／NADP+含量的测定

3．1．6 方差分析

3．2 结果与分析

3．2．1 叶绿体TRXs基因沉默植株表型分析

3．2．2 叶绿体TRXs基因沉默对PSⅡ最大量子产量(Fv／Fm)的影响

3．2．3 叶绿体TRXs基因沉默对PSⅡ及PSⅠ光保护能力的影响

3．2．4 叶绿体TRXs基因沉默对线性及围绕PSⅠ的环式电子传递的影响

3．3 讨论

4 氧化还原靶标蛋白鉴定及叶绿体TRXs对番茄叶片全蛋白表达谱的调控

4．1 材料与方法

4．1．1 植物材料与蛋白样品制备

4．1．2 Diagonal 2D Redox(对角线双向氧化还原)SDS-PAGE

4．1．3 PEG-4000沉淀去除Rubisco蛋白样品的制备

4．1．4 蛋白2-DE(双向电泳)分离及质谱鉴定

4．2 结果与分析

4．2．1 氧化还原调控靶标蛋白的分离和鉴定

4．2．2 不同TRY基因沉默对番茹叶片全蛋白表达谱的影响

4．3 讨论

5 TRX-f及TRX-m1／4参与BRs对番茄光合作用的调控

5．1 材料与方法

5．1．1 植物材料与处理

5．1．2 光合气体交换参数的测定

5．1．3 膜脂过氧化(MDA含量)的测定

5．1．4 非还原性SDS-PAGE及Western杂交分析

5．1．5 Rubisco、Rubisco活化酶及FBPase活性的测定

5．1．6 谷胱甘肽含量的测定

5．1．7 AsA-GSH循环关键酶活性的测定

5．1．8 总RNA提取和基因表达分析

5．1．9 方差分析

5．2 结果与分析

5．2．1 不同BRs水平对叶绿体TRXs基因表达及番茄植株叶片光合能力的影响

5．2．2 EBR处理对叶绿体TRXs基因沉默植株光合作用的影响

5．2．3 EBR处理对叶绿体TRXs基因沉默植株细胞氧化还原状态的影响

5．2．4 EBR处理对叶绿体TRXs基因沉默植株AsA-GSH循环关键酶活性及谷胱甘肽氧化还原状态的影响

5．2．5 EBR处理对叶绿体TRXs基因沉默植株卡尔文循环关键基因表达及酶活性的影响

5．3 讨论

5．3．1 TRX-f、TRX-m2、TRX-m1／4和TRX-y通过AsA-GSH循环和2-CP调控细胞氧化还原状态

5．3．2 TRX-f和TRX-m1／4在BRs诱导细胞氧化还原状态变化的过程中起着重要作用

5．3．3 TRX-f和TRX-m1／4在BRs诱导的光合效率增加的过程中起着重要作用

6 2-CP在番茄高温胁迫响应中的作用及诱导自噬形成

6．1 材料与方法

6．1．1 植物材料与处理

6．1．2 叶片中电解质渗透率测定

6．1．3 叶绿素荧光测定

6．1．4 光合气体交换测定

6．1．5 可溶性／不可溶蛋白的分离和测定及Western杂交分析

6．1．6 抗氧化酶活性的测定

6．1．7 谷胱甘肽及抗坏血酸含量的测定

6．1．8 总RNA提取和基因表达分析

6．1．9 激光共聚焦荧光显微镜检测

6．1．10 方差分析

6．2 结果与分析

6．2．1 2-CP对高温胁迫的响应

6．2．2 2-CP基因沉默增加番茄植株对高温胁迫的敏感性

6．2．3 2-CP基因沉默对高温胁迫下酶类及非酶类抗氧化物质代谢的影响

6．2．4 2-CP基因沉默诱导高温胁迫下可溶性蛋白的氧化及不可溶蛋白的积累

6．2．5 2-CP基因沉默提前诱导高温胁迫下自噬基因的表达及自噬体的形成

6．3 讨论

6．3．1 2-CP作为叶绿体TRXs的靶标蛋白参与番茄高温胁迫抗性

6．3．2 2-CP与AsA-GSH循环相互作用共同调控番茄高温胁迫抗性

6．3．3 自噬介导的氧化蛋白降解在番茄高温胁迫抗性中的作用

7 结论

1．叶绿体TRXs参与调控植物光合电子传递

2．氧化还原靶标蛋白鉴定及叶绿体TRXs对番茄叶片全蛋白表达谱的调控

3．TRX-f及TRX-m1／4参与BRs对番茄光合作用的调控

4．2-CP在番茄高温胁迫响应中的作用及诱导自噬形成

参考文献

作者简历

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摘要

番茄是保护地栽培的主要蔬菜之一，由于产量高，生长及供应的季节长，经济利用范围广泛，所以全国各地都普遍栽培。低温、高温、干旱和盐渍化等是蔬菜生产中普遍遇到的问题，近年来，我国因为上述逆境造成的蔬菜频繁灾害的问题日益突出，因此，如何克服和缓解这些逆境，保证蔬菜的健康生长显得十分必要。油菜素内酯(BRs)具有提高作物光合作用及增加抗逆性的效果，本文先以番茄（Solanum lycopersicum）为材料，利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)获得5个叶绿体相关硫氧还蛋白(Thioredoxin，TRX)基因沉默植株，从光合电子传递、非生物胁迫抗性及蛋白质组学的角度研究了叶绿体硫氧还蛋白的生物功能，并探讨了依赖于硫氧还蛋白的BRs对番茄光合作用及细胞氧化还原状态的调控;又利用VIGS技术获得3个番茄过氧还蛋白(2-Cys peroxiredoxin，2-CP)基因沉默植株，研究了过氧还蛋白在植物高温胁迫抗性中的作用，并研究了该蛋白参与的氧化还原调控诱导高温胁迫下植物叶片全蛋白（可溶性/不可溶蛋白）含量和氧化还原状态的变化及自噬体形成的机制。所得主要结果如下: 1.研究了叶绿体TRXs在调控植物光合电子传递中的作用。病毒诱导的TRX-f、TRX-m2、TRX-x和TRX-y基因沉默植株在表观形态上和对照植株无明显差异，而TRX-m1/4基因沉默植株表现出叶片失绿的症状。通过对光系统Ⅱ(PSⅡ)和光系统Ⅰ(PSⅠ)的情况及光合电子传递速率的测定发现，TRX基因沉默不同程度地加快了围绕PSⅠ的环式电子传递，且通往电子传递终端（NADP+）的电子传递受阻。以上结果表明，叶绿体TRXs通过调控分配通过PSⅡ的线性电子传递和围绕PSⅠ的环式电子传递保证植物光合作用正常进行。 2.分离鉴定了番茄叶片中氧化还原调控靶标蛋白，并研究了叶绿体TRXs对番茄叶片全蛋白表达谱的调控。先利用Diagonal2D Redox SDS-PAGE技术鉴定出Rubisco可通过二硫键被氧化还原调控，然后用PEG-4000沉淀的方法去除高丰度Rubisco的干扰，进一步分离鉴定出其它氧化还原调控靶标蛋白;利用2-DE对pTRV及TRX-f、TRX-m2、TRX-m1/4基因沉默植株叶片全蛋白进行分离，根据差异表达蛋白点鉴定出叶绿体TRX-f、TRX-m2和TRX-m1/4的潜在靶标蛋白。 3.研究了叶绿体TRXs介导的BRs对番茄光合作用的调控。TRX-f、TRX-m2、TRX-m1/4和TRX-y基因沉默增加了细胞膜脂过氧化水平及2-CP蛋白的氧化状态，并抑制AsA-GSH循环关键酶活性降低GSH/GSSG的比率，从而抑制卡尔文循环关键基因表达及酶活性，降低CO2同化速率。BRs缺失突变体（d∧im）中TRX-f、TRX-m2、TRX-m1/4和TRX-x基因表达量下降，而外源BRs处理可以诱导野生型(Condine Red)和d∧im中TRX-f、 TRX-m2、TRX-m1/4和TRX-x基因表达量显著增加。TRX-f和TRX-m1/4基因沉默抑制了BRs对番茄光合作用的增加及对抗氧化和光合相关基因表达和酶活性的增加。这些结果表明，叶绿体TRX-f、TRX-m2、TRX-m1/4和TRX-y参与调控细胞氧化还原状态，其中TRX-f和TRX-m1/4在BRs诱导细胞氧化还原状态的变化及光合作用的过程中起着重要作用。 4.研究了2-CP在番茄高温胁迫响应中的作用及诱导自噬形成的机制。高温诱导2-CP基因表达和蛋白氧化还原状态的变化。病毒诱导的2-CP1、2-CP2和2-CP1/2基因沉默增加了细胞的氧化状态，表现在氧化蛋白的积累及AsA/DHA比率的下降。同时，增加了番茄植株对高温胁迫的敏感性，其中2-CP1/2基因共沉默表现最为明显。高温处理诱导叶片中可溶性蛋白的氧化及不可溶蛋白的不断积累，并诱导自噬体形成，同时，增加了抗氧化相关基因表达及抗氧化酶的活性，但降低了细胞GSH/GSSG及AsA/DHA的比率;2-CP1、2-CP2和2-CP1/2基因沉默加剧了高温胁迫下不可溶蛋白随时间的积累，并诱导自噬体的提早形成，同时，抑制了抗氧化相关基因表达及酶活性的增加，进一步降低了GSH/GSSG及AsA/DHA的比率。这些结果显示，2-CP与AsA-GSH Cycle抗氧化系统共同参与调控番茄高温抗性，该蛋白参与的氧化还原调控诱导高温胁迫下植物叶片全蛋白（可溶性/不可溶蛋白）含量和氧化还原状态的变化及自噬体的早期形成。

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