蛇根木萝卡辛糖苷酶的三维结构表征及底物特异性机制研究

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致谢

摘要

缩略语

20种常见氨基酸

1 引言

1．1 生物碱的药用价值

1．2 印度蛇根木及其生物碱阿吗灵的药用研究背景

1．3 阿马灵的生物合成途径

1．4 生物碱合成途径研究与生物碱的制备

1．5 萝卡辛糖苷酶(RG)的研究背景及立题依据

2 实验材料

2．1 菌株

2．2 培养基

2．3 缓冲系统

2．4 化学试剂及耗材

2．5 生物试剂

2．6 仪器

2．7 结晶及晶体操作用具

3 实验方法

3．1 化合物分析检测方法

3．2 分子生物学方法

3．3 蛋白质的纯化和分析

3．4 结晶

3．5 晶体X-射线衍射数据收集和处理

3．6 序列分析软件及在线分析工具

4．实验结果

4．1 (His)6-RG的异源表达及纯化

4．2 氮端(His)6标签的切除

4．3 RG定点突变

4．4 RG及其突变体对四种糖苷类生物碱的相对活力测试

4．5 野生型RG及RG-W392A突变体对萝卡辛及异胡豆苷的催化动力学研究

4．6 糖苷酶抑制剂对RG的抑制常数测定

4．7 RG晶体的制备

4．8 RG晶体复合物的制备

4．9 冷冻条件下RG单晶衍射数据收集及结构解析

4．10 室温条件下RG单晶衍射数据收集及结构解析

4．11 三维结构模型的验证

4．12 (His)6-RG及(His)6-RG-E186Q整体三维结构

4．13 (His)6-RG复合物和(His)6-RG-E186Q复合物的三维结构

4．14 基于结构的SG底物接受能力理性改造

5．讨论

5．1 RG催化的酶促反应及其重要意义

5．2 RG与结构解析的植物GH1酶的比较

5．3 RG的底物特异性分析

5．4 RG的抑制剂研究

5．5 冷冻与室温条件下收集RG数据比较

5．6 甘油在寻找酶活性中心中的潜在应用价值

5．7 SG的理性改造尝试

5．8 蛋白质晶体制备方法讨论

6 结论

参考文献

文献综述

附录 pQE-2载体多克隆位点示意图

作者简历