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基于比色酶片与金标免疫层析试纸的食品安全快速检测技术研究

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近年来食品安全重大事件层出不断，人们对于国内的食品安全普遍持怀疑态度，如何度过这场“信任危机”是我国食品行业急待解决的问题。现有食品质量监督体系普遍建立在实验室仪器分析技术的基础上，食品的抽样送检过程，不仅耗时费力，且信息发布严重滞后，很难对消费者质疑的产品进行快速反应。同时，由于对监管体制的不信任，越来越多的消费者期望能自己对产品进行快速定性检测，尤其是对每日生活所必需的农副产品。因此，迫切需要发展快速、灵敏、低成本的食品安全现场快测技术。本研究针对食品安全中的农药残留和渔药残留问题，分别研制了比色酶片和金标免疫层析试纸。
　　 基于有机磷与氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制作用，以吲哚酚乙酸酯为酶促水解反应的显色底物，制备了一种抛弃型比色酶片用于农药残留快速检测。在选择了合适的酶源与显色底物后，通过比较不同载体及不同固定方法对于制备酶片性能的影响，最终确定采用物理吸附法将AChE固定到Hybond N+膜上。经过对酶固定过程中的温度、时间、干燥方法及点样酶量的优化，以酶活回收率为指标，确定了酶片制备的具体过程为：将5μL AChE稀释液(800 U/mL)点样到1 cm2的Hybond N+膜中央，4℃下固定30 min后用PBS(0.1 mol/L，pH8.0)冲洗数次，再将酶片真空冷冻干燥并保存于4℃冰箱中，该方法制备的酶片酶活回收率可达27.3％。此外，通过对检测过程中底物浓度、抑制时间和显色时间的优化，确定了最终的检测过程为：取50μL待测样品液滴加至酶片上，30℃下抑制15 min后，用吸水纸吸去多余样品液，滴加10μL的吲哚乙酸酯溶液(10 mmol/L)，10 min后观察显色结果。该酶片显色结果为蓝绿色，通过比较显色强度的变化，酶片对农药标样氧乐果、毒死蜱、敌敌畏、甲胺磷、甲奈威与抗蚜威的检出限分别为1、0.1、2、0.05、1.5与0.8μg/mL。将研制的酶片用于果汁(葡萄汁、苹果汁和橙汁)与生菜样品的检测结果证实，该酶片具有灵敏度高、准确度高、重现性好等优点，可用于农产品中有机磷与氨基甲酸酯类农药残留的快速检测。
　　 基于胶体金免疫层析技术，采用竞争法，以硝酸纤维素(NC)膜为载体，以兔抗氯霉素多克隆抗体为标记蛋白，制备了一种金标免疫层析试纸条用于渔药残留快速检测。该检测系统选用20 nm直径的胶体金用于标记抗体，最适pH为8.0，最适蛋白结合量为每1 mL胶体金结合7.2μg抗体蛋白。标记成功的金标抗体经低温高速离心法纯化后，以1:5比例稀释并取20μL固定到用PBS(0.01 mol/L，pH8.0，10%蔗糖，0.05%吐温-20)预处理过的玻纤膜上，作为金标垫。用于包被NC膜的抗原与二抗浓度分别为1 mg/mL和0.5 mg/mL，各取1μL点样到NC膜上，再用浓度为1%的BSA进行封闭处理。对氯霉素标准水溶液的测试结果显示，本研究制备的试纸条检出限为1.5 ng/mL，整个测试时间约为10 min，重现性良好，且置于4℃环境下保存90 d后仍稳定可靠，为水产品中氯霉素渔药残留的快速检测提供了一条可行途径。

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