松木层孔菌(Phellinus pini),俗名黄芝,属针层孔菌。松木层孔菌对癌细胞具有很强的抑制作用,其子实体水提取物对小白鼠肉瘤180及艾氏腹水癌的抑制率均达100％,民间长期利用松木层孔菌治疗食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌等各种癌症。本课题通过发酵建立松木层孔菌资源人工化技术,解决其资源短缺问题;同时松木层孔菌发酵菌丝进行活性分析和结构鉴定,阐明其药效的物质基础,为松木层孔菌的药用开发提供依据。 1.本研究以松木层孔菌的生物量为指标,运用单因素实验、PB实验、爬坡实验和中心旋转组合实验等多种统计学方法,对野生型松木层孔菌菌种进行深层液体发酵工艺优化,得到较优发酵培养基为85 g L11可溶性淀粉、60 g-1葡萄糖、1 g L-1CaCl2、0.8 g L-1MnSO4、15 g L-1牛肉浸膏、25 gL-1TSB、0.5 gL-1KH2PO4和0.5 g L-1MgSO4·7H2O,摇床转速150 rpm,温度25℃,pH5.0-5.5,可得菌丝干重28.95 g L-1,与起始培养基相比菌丝增加7-10倍。 2.用不同极性的有机溶剂分别对菌丝体和发酵液进行萃取、浓缩,采用MTT法测定其对人胃癌细胞SGC-7901的细胞毒性,实验表明发酵液石油醚部分萃取物的抗肿瘤细胞活性最强,24h IC50为6.26μg ml-1。 3.对发酵液中的次生代谢产物进行分离纯化,寻找具有生物活性的化合物。发酵液经乙酸乙酯萃取、浓缩,分别用硅胶(200-300目)、凝胶LH一20和HPLC等层析柱进行分离纯化,并利用1HNMR、13CNMR、DEPT、HMQC、H M B C、COSY、E I-M S、T O F-M S和FTICR-MS等波普分析技术对所得化合进行结构鉴定,经鉴定得到了4-vinylphenol、Adenine5'-Deoxy-5'-methylthiopentoside、角鲨烯、Drimenol、Drimendiol和p-Vinylphenylβ-D-Glucopyranoside等6个化合物。 4.采用MTT法对以上6个化合物进行人胃癌细胞SGC-7901抗肿瘤活性分析,并以人正常胃细胞GES为对照。结果表明松木层孔菌的次生代谢产物具有促进细胞生长的作用,与中药的临床症状一致,松木层孔菌是一个可以进一步开发的抗癌药材。 综上所述,本研究建立了层孔菌类药用真菌的人工资源化技术,解析了其活性成分,初步评估了其抗肿瘤活性,为层孔菌类药用真菌的新药创制提供了一定的依据。
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