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泛素-26S蛋白酶体途径对寄主和非寄主抗性的调控功能分析

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泛素是一个由76个氨基酸组成的高度保守的小分子蛋白，因广泛存在于各种真核生物细胞中而得名。泛素化是一种蛋白质翻译后修饰(post-translationalmodifications，PTM)，与蛋白质磷酸化信号传导作用相似，其在细胞生命活动的许多进程中发挥着至关重要的作用，比如涉及内吞作用、组蛋白活性和DNA修复等过程。泛素化的蛋白通过26S蛋白酶体进行降解。泛素-26S蛋白酶体途径是植物中高效专一蛋白降解调控机制之一，几乎参与植物生命活动的各个环节。越来越多的研究发现泛素化系统与人类疾病密切相关，但是关于植物泛素化蛋白与植物抗病性的研究较少。本研究利用VIGS技术分析了2个泛素-26S蛋白酶体途径相关基因在植物抗病中的作用，同时运用蛋白质组学技术，研究了本氏烟对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)非寄主抗性表现与不表现时的蛋白差异表达情况，鉴定了表现该非寄主抗性时的泛素化蛋白。获得了以下结果：
　　 (1)采用VIGS技术分析了泛素融合降解蛋白(ubiquitin fusion protein，18-8)基因对植物抗病和抗逆性的调控功能。发现18-8沉默植株产生的Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介导产生的过敏性反应(hypersensitive response，HR)症状比对照显著减轻。18-8沉默植株产生的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)诱导的HR症状也比对照显著减轻。在沉默植株叶片上接种烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci，Pst)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum，Ss)后推迟产生并表现更轻的病害症状。高盐胁迫下，18-8沉默植株的叶片的叶绿素降解比对照明显增强。这些研究结果表明，18-8基因是植物抗病和抗逆性重要调控因子。它可能对Xoo介导的HR和耐盐性起正向调控作用，而对Pst和Ss的抗病性起负调控作用。
　　 (2)通过VIGS技术研究了泛素羧端水解酶(ubiquitin carboxyl-terminalhydrolase，18-5)的基因功能，研究发现80％沉默植株与CK产生了一样强烈的Cf介导的HR反应。18-5沉默植株产生更弱的Xoo诱导的HR和更早更强的干旱萎蔫症状。Ss对沉默植株的侵染情况与CK相似。高盐胁迫下，18-5沉默植株的叶片的叶绿素降解比对照明显增强。。这些研究结果表明，18-5可能参与水稻白叶枯病菌介导的非寄主抗性、耐盐、抗旱等调控。
　　 (3)开展了本氏烟对Xoo的非寄主抗性蛋白质组学分析。通过双向电泳分析，分别获取了MG132处理和MG132+Xoo处理的烟草叶片组织蛋白质图谱。两种处理的蛋白质图谱的比较分析表明，蛋白质丰度变化在2倍以上的差异蛋白点有45个，通过MALDI-TOF-TOF-MS质谱分析成功鉴定了其中36个。其中8/9(32个)在MG132+Xoo处理中表达下调，1/9(4个)表达上调。这些差异表达蛋白主要涉及代谢(25％)、光合作用(25％)、生物合成(氨基酸合成10％、蛋白合成3％和维生素合成3％)、防卫相关蛋白(12％)、蛋白降解(5％)、细胞骨架(2％)、转录调节(2％)、信号传导(5％)、细胞运动(2％)、核质运输(2％)、转录后的基因表达调控(2％)，另外有2％蛋白功能未知。
　　 (4)采用免疫亲和色谱以及色质联用技术进行了表现Xoo诱导的非寄主抗性时的本氏烟植株中的泛素化蛋白。利用泛素抗体柱，通过亲和色谱富集和纯化泛素化蛋白，然后采用液向色谱与纳升级质联用技术，鉴定了MG132+Xoo处理的烟草叶片组织中的泛素化蛋白。在初步分析中已成功检测到10个可信度在90％以上的泛素化蛋白。包括RNAi核心调控蛋白OsAGO1、醛-酮还原酶家族蛋白、ATP合酶、2个未知蛋白。其中6个蛋白与双向电泳结果吻合，说明该结果的可信度较高。

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