狂犬病病毒糖蛋白和磷蛋白在杆状病毒表达系统的真核表达

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狂犬病病毒是单股负链RNA病毒，其基因组长约12kb，由3’端至5’端依次排列着N、P、M、G和L5个狂犬病毒的结构基因，分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录酶大蛋白。由G基因编码的糖蛋白，是病毒与宿主细胞结合的配体，介导了病毒与靶细胞的结合及在神经系统的分布，不但与病毒的毒力、致病性密切相关，而且是狂犬病毒的主要保护性抗原，能刺激机体产生中和抗体，保护机体抵抗病毒的感染。而P基因编码的磷蛋白则是在病毒的复制工程中，与转录酶大蛋白一起发挥作用，磷蛋白是L蛋白的必须辅助因子。本实验采用Bac-to-Bac系统，将糖蛋白基因和磷蛋白基因分别由已构建好的pMD-18T-G载体、pMD-18T-P载体克隆入杆状病毒转移载体pFastBacHTA中，并通过转座将目的基因插入到杆状病毒基因组中，形成含有目的基因的重组杆状病毒。然后将其转染Sf9昆虫细胞，并通过IFA和Western blot等方法来检测目的基因的表达。具体结果如下：
　　根据昆虫细胞对密码子的偏好性，对狂犬病病毒ERA毒株G蛋白基因进行优化并人工合成。根据优化后的序列设计用于扩增目的基因的特异性引物，将其克隆入重组转移载体pFastBacHTA中，成功构建重组转移载体pFastBacHTA-G。然后再将该重组质粒转化DH10Bac/AcNPV感受态细胞，经三重抗性和蓝白斑筛选，获得糖蛋白的杆状病毒表达质粒rBacmid/AcNPV/G。重组表达质粒转染Sf9细胞的IFA鉴定结果显示；与阴性对照相比，转染的Sf9细胞能与抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体发生反应。
　　将狂犬病病毒P基因插入到pFastBacHTA载体，通过发生转座，将目的基因插入到杆状病毒基因组中，从而形成含有P蛋白基因的载体质粒rBacmid-P，然后将其转染Sf9细胞。转染后120h，利用4％甲醛固定细胞进行IFA鉴定，同时，收集转染后发生病变的细胞用于SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果显示，磷蛋白在Sf9细胞中获得了表达。

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作者
徐洁萍;
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作者单位

浙江大学;

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授予单位浙江大学;
学科预防兽医学
授予学位硕士
导师姓名周继勇;
年度 2010
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类其他病毒;
关键词
狂犬病病毒; 糖蛋白; 磷蛋白; 杆状病毒表达系统; 真核表达;

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