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【6h】

α-1，2岩藻糖基转移酶基因新突变位点与功能关系的研究

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综述 Hh血型系统

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摘要

H抗原与ABO血型、Lewis血型密切相关,属于Hh血型系统.Hh血型系统存在孟买型和类孟买型两种罕见表型,表现为红细胞上完全或部分缺失H抗原.红细胞上H抗原受控于Q.1,2岩藻糖基转移酶基因(Q 1,2-fucosyltransfcrase gene,FUTl),已证实FUTl突变可导致孟买型和类孟买型.本实验室在前期研究中通过对FUTl基因编码序列分析,发现类孟买型的一个新突变类型(682A>G+35C>T),该复合突变分别导致A12V和M228V氨基酸替换.国内外有关学者认为35C>T是引起类孟买型的突变点(命名为h4),但我们通过人群频率调查和15种哺乳动物同源的FUTl糖基转移酶氨基酸序列比对,认为35C>T.是多态性位点,应与FUTl酶活性和类孟买型无关,推测应是682A>G突变引起H抗原减弱.本研究目的旨在从体外实验明确该新突变类型(682A>G+35C>T)的机制,从蛋白质和mRNA水平对35C>T,682A>G突变和α-1,2岩藻糖基转移酶功能的关系进行研究,以解决35C>T和682A>G在体外实验中对H抗原表达的影响. 方法： 1.类孟买型先证者采用血清学和分子生物学技术鉴定,实验以类孟买型先证者基因组DNA为研究对象,经PCR扩增FUTl全长编码序列后割胶回收纯化.通过TOPO TA克隆将目的DNA片段连接至表达载体pcDNA3.1/V5-His,克隆筛选后获取重组质粒DNA进行测序分析,以获取包含有目的基因片段的重组质粒,包括35T、682G+35T和正常对照682A+35C的重组质粒. 2. 按照常规细胞培养方法在培养板上培养贴壁细胞COS-7细胞株,将重组质粒采用脂质体转染的方法分别转染处于对数生长期COS-7细胞. 3.转染后COS-7细胞经G418筛选,采用直接免疫荧光染色的方法于第2天、第3天、第4天、第7天流式细胞术分析细胞表面H抗原的表达情况. 4.采用实时荧光定量PCR技术对转染第1天,第2天,第3天的细胞检测mRNA水平FUTl的表达情况,以G6PD为内参基因,FUT1为目的基因,分别选用标准PCR产物和质粒纯品作为标准品做标准曲线对样本进行定量比较. 结果： 1.获取目的基因重组质粒以先证者或正常对照基因组DNA为模板,FIJTlF和FUTlR引物对扩增FUTl基因,2﹪琼脂糖凝胶电泳结果显示可见分子量为1094bp的特异性条带,将其割胶回收片段TOPO TA.克隆,提取质粒测序分析结果,分别获取35T、682G+35T和正常对照682A+35C的重组质粒. 2.转染后抗原分析通过FITC标记的抗H抗体对转染后COS-7细胞表面的H抗原进行检测,结果显示转染空质粒的COS-7细胞不表达H抗原,第2天后H抗原分别在35T、682G+35T和682A+35C三种重组质粒转染的COS-7细胞膜上表达,表达量随着时间呈现先递增后下降的趋势,在第4天达最大值.与野生型(682A+35C)重组质粒相比,(682G+35T)质粒H抗原的表达量仅为野生型的13.3﹪,而35T.为野生型的52.7﹪. 3.转染后mRNA分析我们通过标准品绘制双标准曲线分别对转染第1天、第2天、第3天的COS-7细胞胞内FUTl目的基因与G6PD内参基因进行了定量分析和比较.结果显示转染后FUTl mRNA水平随着时间变化呈递减,在第l天(682G+35T)FUTl mRNA水平仅为(682A+35C)的40﹪. 结论：1.实验成功获得了FUTl重组表达质粒,构建了FUTl体外瞬时表达体系,体外从蛋白质水平证实类孟买型H抗原呈弱表达的特点.2.体外从蛋白质水平证实35C>T可引起H抗原的表达部分下降.3.证实682A>G+35C>T复合突变引起H抗原表达明显减少,推测Met228的改变可影响α-1,2岩藻糖基转移酶活性.4.证实682A>G+35C>T突变影响FUTl的转录活性.

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