青海湖裸鲤HIF-1α和GH-IGFs的分子进化及高原盐湖水环境对其表达的影响

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青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii，Przewalskii)，俗称湟鱼，生活于高盐(9ppt)、高pH(pH 9.1-9.5)和高海拔(平均3260米)的青海湖中。每年三月至七月，青海湖裸鲤从湖水至入湖河流进行生殖洄游，青海湖裸鲤的生长极为缓慢，生长300-500g平均需要七到十年时间。本文首先克隆了裸鲤HIF-1α，GH，IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因，并对其分子进化和相关功能进行了研究，这对阐述裸鲤环境适应的机制和资源保护具有重要的理论和实践意义。水环境中溶氧浓度的大幅度变化，对鱼类的生长和进化有明显的影响。转录调节因子HIF-1(低氧诱导因子-1)在动物体内的氧平衡调节中发挥十分重要的作用。本文首次从青海湖裸鲤中克隆了HIF-1α基因，其cDNA序列长度为2707bp，编码由773个氨基酸残基组成的蛋白质。青海湖裸鲤HIF-1α和大鼠、虹鳟鱼、鲫鱼HIF-1α分别具有57％、62％、89％的一致性。序列分析、Western Blot和EMSA检测结果表明，青海湖裸鲤HIF-1α中的主要功能氨基酸、TAD-C域的C末端高度保守，提示青海湖裸鲤HIF-1α表达和转录活性的调节，与其它鱼类具有相同的机制，与哺乳类也可能有相似之处。在bHLH区中，青海湖裸鲤碱性：DNA结合区域和其它鲤科鱼类一致，但与二聚体结合有关的HLH区发生了5个氨基酸的变异，说明青海湖裸鲤HIF-1α对低氧应答元件HRE的识别结合和其它鲤科鱼类没有差异，但在转录因子与二聚体伙伴的结合方面可能有所不同。通过遗传距离计算和分歧年代分析，我们发现目前已克隆的10种硬骨鱼类HIF-1α序列，与哺乳动物相比具有较快的进化速率。我们采用最大似然法模型，分析脊椎动物HIF-1α基因进化过程中自然选择的变化规律，表明鱼类具有相对较快的进化速率，主要源于纯化选择压力的减轻。发现在青海湖裸鲤、鲫鱼和Antarctic eelpout中，中性位点的比例分别为34％、32％和38.8％，明显高于其它硬骨鱼类(约22％)，这可能与基因组重复以及独特的低氧适应机制相关。在鱼类中，GH-IGF-Ⅰ参与生长的调节，还参与广盐性鱼类海水适应的渗透调节过程。为了了解青海湖裸鲤GH和IGFs的生理作用，本文首先克隆了青海湖裸鲤GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因。GH基因CDS区长为633bp，编码由210个氨基酸组成的GH前体。IGF-Ⅰ cDNA序列CDS区全长为537bp，编码由178个氨基酸组成的IGF-Ⅰ前体。IGF-Ⅱ cDNA序列CDS区全长为639bp，编码由212个氨基酸组成的IGF-Ⅱ前体。青海湖裸鲤属于四倍体鲤科鱼类，其GH的进化速率和中性位点比例，介于其它四倍体鲤科鱼类和二倍体鲤科鱼类之间，提示在青海湖裸鲤中，基因组重复减轻纯化选择压力的作用被削弱。青海湖裸鲤IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在鲤科鱼类中高度保守。为了研究青海湖裸鲤对高原盐湖水环境的适应性反应，我们将青海湖裸鲤暴露于四组不同水环境中：河水组、钠离子组(河水中加入氯化钠使钠离子浓度等于湖水)、镁离子组(河水中加氯化镁使镁离子浓度等于湖水)和湖水组，分别处理2天和5天。放射免疫法检测裸鲤血浆GH、IGF-Ⅰ水平和下丘脑SS水平，NorthernBlot和半定量RT-PCR法检测肌肉IGF-Ⅰ和肝脏IGF-Ⅱ的表达。结果显示：1)处理2天，与河水组比较，湖水组血浆GH水平明显上升，而钠离子组和镁离子组没有明显变化；钠离了组下丘脑SS水平明显上升；钠离子组和湖水组血浆IGF-Ⅰ水平明显上升，而镁离子组没有明显变化。2)处理5天，各组之间血浆GH、IGF-Ⅰ和下丘脑SS水平没有明显差异。3)钠离子、镁离子和湖水处理2天，和对照组(河水组)相比，青海湖裸鲤肝脏IGF-ⅡmRNA水平下降，湖水组青海湖裸鲤肌肉IGF-ⅠmRNA水平有明显下降；钠离子、镁离子和湖水处理处理5天，青海湖裸鲤肝脏IGF-ⅡmRNA水平明显高于河水组。4)不同水环境处理2天和5天，和河水组相比，湖水组血糖水平明显上升，钠离子组和湖水组肝脏糖原显著升高。结果提示，钠离子组下丘脑SS水平短暂性升高，可能是裸鲤暴露于高盐中性水环境中的应激反应；青海湖裸鲤GH和IGF-Ⅰ参与从淡水到咸水环境的渗透调节反应，和糖代谢水平变化的调节，这是首次在鲤形目鱼类中报道GH-IGF-Ⅰ参与渗透调节反应。综上所述，青海湖的高原低氧盐湖环境，对青海湖裸鲤低氧适应、生长与渗透调节相关基因的进化和功能产生了不同的影响。在已知的脊椎动物HIF一1 alpha中，裸鲤低氧诱导因子HIF-1 alpha是进化速率最快的基因之一，但主要功能域基本保守，我们认为这是基因组重复和低氧耐受机制共同作用，从而减轻了纯化选择压力的结果。我们观察到裸鲤GH-IGF-Ⅰ参与渗透调节反应，这是鲤形目鱼类中的首次报道，并和裸鲤GH的进化特点相符，青海湖裸鲤GH的进化速率介于其它四倍体鲤科鱼类和二倍体鲤科鱼类之间，参与渗透调节的生理功能可能削弱基因组重复减轻纯化选择压力的作用。青海湖裸鲤IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在鲤科鱼类中高度保守，并与青海湖裸鲤生长、渗透压调节以及细胞应激保护等重要生理作用有关。

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作者
曹诣斌;
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作者单位

浙江大学;

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授予单位浙江大学;
学科生理学
授予学位博士
导师姓名杜继曾,陈学群;
年度 2007
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 Q959.468;
关键词
青海湖; 青海湖裸鲤; HIF-1α; 低氧; 分子进化; GH; IGF-Ⅰ; IGF-Ⅱ; 渗透调节;

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