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DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学实时分析体系的建立及在细胞内阻断丙型肝炎病毒基因表达的实验研究

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研究路线图

第一部分：DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学实时分析体系的建立

第二部分：DNAzyme/LNAzyme阻断丙型肝炎病毒基因表达的细胞内效应

一、HCV-UTR/C126-EGFP融合蛋白真核表达质粒的构建与鉴定

二、稳定表达HCV-UTR/C126-EGFP的HepG2细胞系的筛选与鉴定

三、DNAzyme/LNAzyme阻断丙型肝炎病毒基因表达的细胞内效应

小结

文献综述：DNAzyme及LNAzyme的研究进展

参考文献

附录

致谢

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摘要

自从核酶这一具有催化活性的RNA分子被发现以后，国内外研究者自然地将目光转向另一类生物大分子-DNA，力图寻找和证实一类具有催化功能的DNA分子。具有10-23基序的DNAzyme是一种高效且广泛催化RNA切割反应的单链DNA分子，它是体外选择(invitroselection)实验过程的第10轮次筛选出的第23号克隆，称之10-23DNAzyme。它由15个脱氧核糖核苷酸(5'GGCTAGCTACAACGA3')构成催化结构域，两侧分别有由7-8个脱氧核糖核苷酸构成的底物识别结构域。通过其两侧的底物识别序列与RNA底物通过Watson-Crick碱基配对而特异结合。其切割位点位于RNA分子上的未配对的嘌呤(R=A或G)和已配对的嘧啶(Y=U或C)之间。通过合理设计DNAzyme底物认别部位的核苷酸序列，可对不同的靶RNA分子进行切割。近来研究又发现，通过对DNAzyme的底物识别序列进行一定的化学修饰如在其识别结构域上引入几个LNA(lockednucleicacid)单体，可显著增强其化学结构的稳定性和切割效率，称之为LNAzyme。 由于DNAzyme/LNAzyme能在RNA的A·U位点切割，理论上它可切割任何mRNA的翻译起始密码AUG，这意味着几乎找到了可调控所有蛋白表达的万能钥匙，而目前国内外的一些研究包括我们的前期工作均表明，DNAzyme/LNAzyme确是一种潜在的强有力的RNA特异性切割工具。这为抑制RNA病毒的复制和RNA病毒感染性疾病的基因治疗开辟了一条新途径，具有重要的研究意义和潜在的临床应用价值。 丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)是单股正链RNA病毒，属黄病毒属。HCV基因组RNA由约9,400核苷酸(nt)组成，含5'非编码区(untranslatingregion，UTR)、结构区(C、E区)、非结构区(NS区)和3'UTR。HCVRNA含有一个由C区第一位AUG起始的单一开放读码框架(openreadingframe，ORF)，翻译为一大多聚蛋白前体，然后在宿主信号肽酶及NS3蛋白激酶的作用下，裂解成各种病毒蛋白。因此，HCVORF起始AUG无疑是一非常理想的基因阻断位点，在该位点用DNAzyme或LNAzyme对HCVRNA进行特异的切割，将能十分有效地阻断HCV唯一的ORF的翻译表达。并且，虽然HCV有多种基因型，各型间的基因序列存有差异，但在HCVORF起始AUG上下游近20nt的序列，在各型HCV间却是十分保守的，因此，针对该位点的DNAzyme/LNAzyme可以切割各型HCVORF。 本研究从细胞外和细胞内两个方面均论证了针对HCVORF起始AUG设计的DNAzyme/LNAzyme对HCV基因表达的特异阻断作用。 为阐明DNAzyme/LNAzyme能在细胞外阻断HCV基因的表达，在本研究第一部分，应用FAM/BHQ荧光标记法，首次成功建立了一种在生理条件(37℃)下，实时分析DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学的体系，可实现快速、准确且高通量的研究DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学特征。在此体系下，筛选出能在HCVORF起始AUG位点进行有效、特异切割的DNAzyme/LNAzyme。 为阐明DNAzyme/LNAzyme能在细胞内阻断HCV基因的表达，在本研究第二部分，以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)作为报告分子，通过构建HCV-UTR/C126-EGFP融合蛋白真核表达质粒，在瞬时转染和稳定转染的HepG2细胞内，均成功观察到其阻断HCV基因表达的细胞内效应。 因此，本研究充分表明，针对HCVORF起始AUG设计的DNAzyme/LNAzyme能够特异阻断HCV基因的表达。这为在体内应用DNAzyme/LNAzyme作为HCV基因治疗的新型工具奠定了实验基础，也为研究HCV感染的致病机制提供了一种重要的手段。此外，本研究首次成功建立了一种在生理条件(37℃)下，实时分析DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学的体系，这必将为今后快速、准确且高通量的研究DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学特征起到十分重要的作用。 第一部分：DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学实时分析体系的建立目的：建立一种实时分析DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学的体系。 方法： 1.设计和合成了针对HCVORF起始AUG位点的底物结合臂长为9的DNAzyme/LNAzyme，分别命名为Dz-HCV-9、Lz-HCV-9，以及其识别结合序列的错配体Dz-HCV-Mis-9、特异催化序列的变异体Dz-HCV-Mut-9、反义寡核苷酸ASON和无关寡核苷酸NSON作为对照； 2.根据HCVORF起始AUG位点上下游的碱基序列，设计合成一条用于细胞外切割反应的杂合RNA序列，全长25nt。该杂合RNA分子的5'端和3'端分别用荧光基团FAM和淬灭基团BHQ标记； 3.在生理条件下(37℃)，实时分析DNAzyme/LNAzyme及其对照对靶RNA的切割反应动力学； 4.分析影响DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学的因素。 结果： 1.具有特异化学结构的Dz-HCV-9和Lz-HCV-9均能在靶RNA的A·U位点进行切割反应，可实时检测到荧光强度随反应时间的变化过程；而作为对照的Dz-HCV-Mis-9、Dz-HCV-Mut-9、ASON及NSON均无特异切割反应，荧光强度随时间的进程并无明显改变。 2.不同底物结合臂长、不同Mg2+浓度、不同pH均会影响DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学。 结论：首次成功建立一种在生理条件下(37℃)，实时分析DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学的体系，可快速、准确且高通量的研究DNAzyme/LNAzyme切割RNA反应动力学特征。 第二部分：DNAzyme/LNAzyme阻断丙型肝炎病毒基因表达的细胞内效应目的：研究DNAzyme/LNAzyme阻断丙型肝炎病毒基因表达的细胞内效应。 方法： 1.采用基因重组技术构建了HCV-UTR/C126-EGFP融合蛋白真核表达质粒，并经PCR、酶切、序列测定及在不同细胞内表达等方法进行鉴定； 2.采用G418压力选择和有限稀释法筛选能稳定表达融合蛋白HCV-UTR/C126-EGFP的HepG2细胞系，并经PCR、SouthernBlot、RT-PCR、流式细胞术等方法进行鉴定； 3.将针对HCVORF起始AUG位点的DNAzyme/LNAzyme与融合蛋白真核表达质粒pHCV-UTR/C126-EGFP共转染HepG2细胞，通过荧光显微镜、流式细胞仪和半定量RT-PCR检测分析DNAzyme/LNAzyme阻断HCV基因在细胞内的瞬时表达效应。再将DNAzyme/LNAzyme转染能稳定表达融合蛋白HCV-UTR/C126-EGFP的HepG2细胞系，通过流式细胞仪检测分析其阻断HCV基因在细胞内的稳定表达效应。 结果： 1.成功构建HCV-UTR/C126-EGFP融合蛋白真核表达质粒； 2.成功筛选出能稳定表达HCV-UTR/C126-EGFP的HepG2细胞系； 3.成功观察到针对HCVORF起始AUG位点的DNAzyme/LNAzyme在瞬时转染和稳定转染HepG2细胞内均能阻断HCV基因的表达。 结论：针对HCVORF起始AUG位点的DNAzyme/LNAzyme能在细胞内阻断HCV基因的表达，可作为HCV基因治疗的新型工具。并为研究HCV感染的致病机制提供一种手段。

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