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HPV16E7多肽疫苗对人免疫重建荷SiHa细胞SCID鼠的免疫功能的影响及宫颈癌发生过程中免疫逃逸机制的研究

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前言

第一部分HPV16E7多肽疫苗对人免疫重建荷人宫颈癌细胸株SiHa细胞SCID鼠免疫功能的影响

第二部分子宫颈癌发生过程中免疫逃逸机制的研究

第三部分子宫颈癌发生过程中主动免疫反击机制的研究

参考文献

综述一治疗性HPV多肽疫苗的研究进展

综述二HPV感染后的宫颈局部免疫

综述三HPV免疫识别机制研究进展

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致 谢

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摘要

宫颈癌的发生率为妇科恶性肿瘤之首，死亡率居妇科恶性肿瘤第二位。目前对宫颈癌的治疗包括放疗、手术、化疗等，但仍有大量的患者复发而死亡，而对那些复发病例的治疗效果相对较差，因此，需要寻求新的治疗手段。大量流行病学调查发现宫颈癌与人乳头状瘤病毒(HPV)感染密切相关，并以HPV16最为常见。HPVE6和E7持续表达于宫颈癌细胞，具有免疫原性，是免疫治疗理想的靶抗原。与活的或重组疫苗比较，多肽疫苗可特异地直接针对免疫系统的特异免疫表位。多肽疫苗安全，相对易于临床生产，对较少的免疫表位诱发特异的免疫应答，疫苗治疗的在于提高针对E6和E7病毒蛋白的细胞免疫反应，从而清除HPV感染的细胞。但目前尚不能体外培养HPV，而且HPV具有严格的种族特异性，限制了HPV动物模型的使用。以细胞和体液严重联合免疫缺陷为特征SCID鼠的发现，在SCID鼠体内人免疫功能重建的成功，实现了在动物体内研究人类免疫细胞和人类肿瘤的关系。 虽然有迹象表明在免疫抑制的患者中，宫颈肿瘤的发生率明显增高，但是HPV相关肿瘤发病过程中免疫应答所起的作用并不清楚。尽管已有多种宫颈癌HPV疫苗研发的报道，其中部分已进入临床验证，但从现有资料来看，大多疗效不尽如人意。究其原因与肿瘤细胞逃逸宿主免疫监视有密切关系。这种免疫逃逸是由于肿瘤细胞所行使的防御机制和/或宿主免疫系统功能受损，可以归纳为两种机制即肿瘤细胞的被动免疫逃逸和肿瘤细胞的主动攻击。 肿瘤细胞被动免疫逃逸的机制主要为肿瘤细胞缺乏共刺激分子和低表达MHC分子。MHC-Ⅰ类分子在肿瘤细胞的免疫识别和效应过程中起着重要作用。CD99可调节MHC-Ⅰ类分子从高尔基体转运至细胞表面的表达。HLA-G是一种非经典的HLA-Ⅰ类抗原，可能是肿瘤免疫逃逸的机制之一。目前对MHC-Ⅱ类分子异常表达的生理和病理学意义还不清楚。 肿瘤细胞的主动攻击是指肿瘤细胞可以通过对自身表面分子的表达的改变来逃避机体的免疫监视，使机体的全身免疫功能及局部免疫功能受到抑制。肿瘤细胞表达FasL，与Fas结合，可诱导淋巴细胞进入凋亡，被认为与人类肿瘤的“免疫反击”。 为此，我们以接种SiHa细胞株(表达HPV16)的人免疫重建SCID鼠为研究对象，在国内外首次建立免疫重建荷人HPV16阳性宫颈癌SCID鼠模型，继以HPV16E7多肽疫苗辅以T辅助细胞免疫表位，乳化于IFA中接种于SCID鼠，观察其生物学特性及其对免疫功能的影响；并研究宫颈癌发生过程中免疫调节分子HLA-DR、CD99和HLA-G所起的作用，了解被动免疫逃逸机制在宫颈癌发生中的作用；通过检测Fas、FasL和c-FLIP在正常宫颈、CIN和宫颈鳞癌中的表达，了解Fas/FasL途径在宫颈癌发生中作用，旨在提高HPV疫苗的临床疗效。 第一部分HPV16E7多肽疫苗对人免疫重建荷人宫颈癌细胞株SiHa细胞SCID鼠免疫功能的影响目的观察HPV16E7多肽疫苗对人免疫重建荷人宫颈癌细胞株SiHa细胞严重联合免疫缺陷(SCID)鼠移植瘤的影响。方法对SCID鼠腹腔注射人外周血淋巴细胞(PBL)后24小时，皮下接种HPV16阳性的人宫颈癌细胞株SiHa细胞，建立人免疫重建荷SiHa细胞的SCID鼠模型，当移植瘤最小体积达100mm3时，三次背部皮下接种疫苗，每次接种间隔二周，观察荷瘤鼠一般生物学特性，检测血浆中人IgG含量、外周血中人CD3+、CD4+、CD8+T细胞、脾重、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以及脾细胞毒杀伤功能。实验设立空白组，仅为腹腔内注射PBL，疫苗成份仅为不完全佐剂(IFA)；随机多肽组，为腹腔内注射PBL，皮下接种SiHa细胞，疫苗成份仅为随机多肽+T辅助多肽+IFA；T辅助多肽组，为腹腔内注射PBL，皮下接种SiHa细胞，疫苗成份仅为T辅助多肽+IFA；多肽治疗组，为腹腔内注射PBL，皮下接种SiHa细胞，疫苗成份为HPV16E711-20(YMLDLQPETT)，HPV16E7s6-93(TLGIVCPI)+T辅助多肽+IFA。结果各组SCID鼠血浆中人IgG水平，8周内随重建时间延长而升高(P＜0.05)，多肽治疗组达2957.85μg/ml，但各组间无显著性差异；外周血中均可检测到人CD3+、CD4+、CD8+T细胞，但各组间无显著性差异(P＞0.05)；与空白组比较，其他三组SCID鼠脾重均显著增加(P＜0.05)。组织学观察到移植瘤局部TIL浸润及明显的出血和坏死，但经免疫组化未检测到人CD8+T细胞。与空白组比较，多肽治疗组、随机多肽组、辅助多肽组的脾细胞毒杀伤功能均显著降低(P＜0.05)。结论人免疫功能重建的荷SiHa细胞的SCID鼠体内重建的人免疫功能随荷瘤时间的延长受到抑制，多肽疫苗在一定程度上能减轻免疫抑制状态。 第二部分子宫颈癌发生过程中被动免疫逃逸机制的研究目的研究宫颈癌发生过程中细胞膜分子HLA-DR、HLA-G和CD99的作用。方法应用特异性抗体HLA-DR、HLA-G和CD99，用免疫组化方法检测19例正常宫颈组织、15例CINI、22例CINⅡ、23例CINⅢ和34例宫颈鳞癌中HLA-DR、HLA-G和CD99蛋白的表达，并检测Ki67的表达情况。结果在正常宫颈和CIN中，除了3例CINⅢ外，均不表达HLA-DR，在宫颈鳞癌组织中，中分化和低分化鳞癌HLA-DR的表达显著高于高分化鳞癌(P＜0.05)。所有正常宫颈标本均呈HLA-G强表达，阳性颗粒位于宫颈鳞状上皮和宫颈管内的柱状上皮。只有小部分CINs和SCCs表达HLA-G，与正常对照组比较，CINs和SCCs中HLA-G的表达显著降低(P＜0.001)。SCCs中CD99的表达显著高于正常宫颈组织(P＜0.01)和CINs(P＜0.05)。所有标本均可见Ki67阳性染色细胞。在SCCs和CINs中，Ki67的表达显著高于正常对照组(P＜0.001)，但SCCs和CINs间Ki67的表达无显著性差异。结论HLA-DR和CD99表达增高可能与宫颈癌的发生有关。 第三部分子宫颈癌发生过程中主动免疫攻击机制的研究目的检测凋亡相关抗原Fas、FasL和cFLIP在宫颈癌细胞的表达方式，研究Fas介导的凋亡在宫颈癌发生中的作用。方法应用特异性抗体Fas、FasL和cFLIP，用免疫组化方法检测19例正常宫颈组织、15例CINI、22例CINⅡ、23例CINⅢ和34例宫颈鳞癌中Fas、FasL和cFLIP蛋白的表达，并用TUNEL检测所有标本中凋亡指数。结果在CINⅠ、CINⅡ和正常宫颈，Fas的表达无显著性差异；在宫颈中分化鳞癌中，Fas的表达高于CINⅢ和宫颈高分化鳞癌，而宫颈低分化鳞癌中，Fas的表达低于宫颈中分化鳞癌，但均未达到显著性差异。在CINs中几乎不表达FasL，但随着肿瘤分化程度的下降，FasL的表达显著增加。从正常宫颈→CINs→宫颈癌，cFLIP的表达逐渐增高，并随分化程度的下降，cFLIP的表达呈增高趋势，但不同分化程度间的表达，差异无显著性。从正常宫颈到宫颈鳞癌，凋亡指数呈下降趋势(p＜0.05)。在SCCs中行各指标间的相关性分析，发现Fas的表达与cFLIP呈正相关(r=0.423，p=0.000)，而cFLIP的表达与凋亡指数呈负相关(r=-0.499，p=0.000)。结论Fas/FasL系统调节异常和宫颈鳞癌中cFLIP的表达增加，可能是宫颈鳞癌转化和发生过程中逃逸凋亡的重要机制。

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