双齿围沙蚕消化道D2菌株胞外蛋白酶的制备及其抗肿瘤活性的初步探讨和重组质粒pEGFP-N3-c-myc的构建

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目的：培养双齿围沙蚕消化道高产蛋白酶菌株D2，分离纯化其胞外蛋白酶并研究此蛋白酶的抗肿瘤活性。方法：挑取菌株 D2的单个菌落，接种于肉膏蛋白胨培养液中，振荡培养，以发酵液上清为材料，经80％饱和硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析、Superdex G-75凝胶过滤层析分离纯化D2胞外蛋白酶；将分离纯化所得的D2蛋白酶粉末溶于RPMI1640培养基中，经过滤除菌配制成浓度为0.2～2000mg/L的蛋白酶溶液，选用鼠乳腺癌细胞EMT6作为实验组，相应细胞加入药物溶解介质为阴性对照组，人胚肺细胞(HELC)作为正常细胞对照组，各个浓度的蛋白酶溶液分别作用于实验组和正常细胞对照组细胞3h、6h、12h、24h和48h，通过体外细胞培养法进行细胞增殖抑制率检测，应用MTT法测其OD值，计算细胞增殖抑制率；以紫杉醇( PTX)在体内的血浆峰值浓度Cmax(Cmax=3.65mg/L)为中间值，测试5个等比浓度(公比为10)，使其终浓度为0.0365～365mg/L；，检测其对EMT6细胞的增值抑制率，作为阳性对照组；将实验组与正常细胞对照组以及阳性对照组比较。结果：纯化得到电泳纯的D2蛋白酶，纯化倍数4.9，活性回收率33％；实验组、阳性对照组以及以及正常细胞对照组的OD值均小于阴性对照组，阳性对照组实验组OD均低于正常细胞对照组，且存在时间和剂量依赖关系；实验组细胞的增殖抑制率高于正常细胞对照组(P<0.05) 结论：双齿围沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株胞外蛋白酶对鼠乳腺癌细胞EMT6存在增殖抑制作用，显示出一定的抗肿瘤活性。

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作者
徐莉莉;
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作者单位

青岛大学;

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授予单位青岛大学;
学科病原生物学
授予学位硕士
导师姓名王斌;
年度 2009
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类乳腺肿瘤;
关键词
乳腺癌; 双齿围沙蚕消化道; D2蛋白酶; 抗癌活性;

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