多重荧光定量RT-PCR同时检测甲型乙型流感病毒方法的建立及其初步应用

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目的建立一种快速、敏感、特异的多重荧光定量RT一PCR同时检测甲型乙型流感病毒，并将建立的方法进行初步临床应用研究。方法 1．甲型乙型流感病毒的引物及Taqman探针的设计，选取两种病毒的基因序列保守区，根据引物设计软件DNASTAR设计引物和探针。对甲型乙型的探针标记不同的荧光素，甲型标记FAM，乙型标记VIC。 2．多重荧光定量RT-PCR反应体系中，甲型乙型流感病毒的两套引物及两种探针浓度的优化。 3．对甲3／悉尼／5／97、乙／深圳／12／97流感病毒进行病毒效价滴定(106TCID50／m1)，TCID．~oE口是组织细胞培养半数感染剂量，然后稀释成100、10、1、0．1、O．0l、0．001TCID．~o，提取病毒RNA作为敏感度的标准，多重荧光定量RT一PCR反应和常规的RT-PCR以及和病毒分离培养的灵敏度作比较。 4．在多重荧光定量RT-PCR反应体系中加入其它的呼吸道病毒提取的RNA，检测反应体系的特异性． 5．用多重荧光定量RT-PCR在对40例疑似流感含漱液标本进行初步的应用．结果 1．引物与探针的设计与合成：我们选取甲型流感、乙型流感高度保守区，甲型选取编码基质蛋白(M)区，乙型选取编码血凝素基因区(HA)。甲型流感的探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA，乙型流感的探FluA-1F:5'-GGACTGCAGCGTAGACGCTT-3'核酸位点:217-236FluA-2R:5'-CATCCTGTTGTATATGAGGCCCAT-3'382-405FluA-3R:5'-CATTCTGTTGTATATGAGGCCCAT-3'382-405FluAprobe:5'-CTCAGTTATTGTGCTGGTGCACTTGCCA-3'349-376FluB-1F:5'-AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA-3'970-995FluB-2R:5'-CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA-3'1119-1139FluBprobe:5'CACCCATATTGGGCAATTTCCTATGGC-3'1024-1050针5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的与甲型一样。设计的甲型流感有两条反向引物，只有在5’第4个碱基不同，目的是为了扩增出所有的甲型流感的亚型。引物和探针的序列： 2．多重荧光定量RT-PCR反应体系中引物及探针的浓度优化：两套引物的浓度分别配成200、400和600nmol／L，甲型乙型探针的浓度分别配成100、200、300nm01／L，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，以0．4umol／L的甲型引物浓度与0．6umol／L的乙型引物浓度及两种探针的浓度分别为200nmol／L获得的Ct值较小而荧光强度最大。在该条件下，多重荧光定量RT-PCR反应体系最合适。 3．多重荧光定量RT-PCR反应体系的灵敏度：多重荧光定量RT-PCR反应在两种参考病毒效价滴度稀释0.001TCID,~o倍时，检测甲型流感的Ct值为35．12，检测乙型流感的Ct值为33．06，检测呈阳性，常规的RT-PCR在稀释至0．1TCIDs。时能扩增出条带，0．01TCIDs。时条带扩增不出。用MDCK培养分离只能在1TCIDs。能观察到细胞病变效应。 4．多重荧光定量RT一PCR反应体系的特异性：流感病毒甲3／悉尼／5／97，甲1／北京／56／97，乙／深圳／12／97，甲3／浙江／78／00，甲3／浙江／52／04麻疹病毒沪191，风疹病毒GOS株，流行性腮腺炎病毒TeryLyn株，呼吸道合胞病毒Long株的RNA提取物作为模板分别加入多重荧光定量RT-PCR进行测定，除流感病毒出现很好的阳性结果外，其它所有病毒的检测结果均呈阴性。 5．流感疑似患者临床样本的检测对我市疑似流感暴发疫情及流感监测医院送检的40份患者含漱液应用多重荧光定量RT一PCR方法与病毒分离方法进行检测，其中病毒分离阳性8份(20％)，多重荧光定量RT一PCR阳性17份(42．5％)，这二者检测的阳性患者结果一致。为排除多重荧光定量RT一PCR假阳性，用血凝抑制实验检测双份血清(急性期、恢复期)的血凝抑制效价，经检测诊断为流感近期感染。结论 1．我们建立的多重荧光定量RT一PCR同时检测甲型乙型流感病毒的方法是利用TaqMan技术是在普通PCR原有的一对特异性引物基础上增加了一条特异性的荧光双标记探针。利用该探针能与病原核酸特异性结合，而且结合部位位于引物结合区域，探针的5’端和3’端分别标记不同的荧光素，在PCR扩增过程中，利用检测系统中荧光量的变化，通过检测仪检测并记录的荧光信号的变化判定检测结果。 2．检测方法学评价：经标准毒株与临床样本的检测比较，发现它不仅特异性高，而且比常规盯一PCR和病毒分离法更敏感，快速，也更简便。通常流感病毒的RT一PCR检测敏感度在0．1TCID50左右，从病毒核酸提取，RT-PCR反应与电泳，整个过程大约需6～7h左右。而采用本方法从核酸提取至完成检测，仅需3h左右，敏感度可达0．001TCID50。 3．采样标本检测结果及评价：可直接从疑似患者含漱液标本中检测同时检测到甲型或乙型流感病毒，我们在40例标本中，检出10例甲型流感，7例乙型流感，不仅节约成本，而且PCR产物不污染环境。为疑似流感暴发疫情的实验室应急诊断提供了一种快速、有效的实验室检测手段。

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作者
赵丹燕;
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作者单位

温州医科大学;

温州医学院;

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授予单位温州医科大学;温州医学院;
学科临床检验诊断学
授予学位硕士
导师姓名陶志华;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类鉴别诊断学;
关键词
流感病毒; 甲型流感病毒; 乙型流感病毒; TaqMan技术; 多重荧光定量检测;

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