禽鹦鹉热嗜性衣原体DNA疫苗的构建和免疫应答评价

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禽鹦鹉热嗜性衣原体是一种重要的人畜共患病，随着我国集约化养殖业的不断发展，禽鹦鹉热嗜性衣原体的感染呈现上升的趋势，本病的流行已严重阻碍养殖业的发展和威胁人类健康。目前尚未有商品化的禽鹦鹉热嗜性衣原体疫苗上市，因此，开发高效、价廉的新型疫苗势在必行。已有研究证明衣原体Omp-1基因编码的主要外膜蛋白(Major Outer Membrane Protein，MOMP)是其主要保护性抗原成分且具有种属特异性，本实验克隆Omp-1基因并构建了pcDNA3-1-Omp-1DNA疫苗，同时配合重组主要外膜蛋白和佐剂CpG免疫SPF鸡旨在探讨增强鹦鹉热嗜性衣原体DNA疫苗的途径。方法： ①根据禽鹦鹉热嗜性衣原体Omp-1基因序列，设计了一对含有EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点的引物。利用聚合酶链反应(PCR)扩增禽鹦鹉热嗜性衣原体Omp-1基因，用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切该片段，回收得到含有以上两个酶切位点粘端的Omp-1基因，将此基因克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1(+)真核表达载体中。 ②纯化重组真核表达质粒pcDNA3.1-Omp-1，脂质体介导方法转染哺乳动物细胞BHK<,21>，RT-PCR和Western-blot方法鉴定目的基因在BHK<,21>细胞中的瞬时表达。 ③根据文献报道合成了一条禽用硫代磷酸化修饰的CpG序列5’TCGTCGTTTTGTCGTITTGTCGTT3’(命名为CpG2006)。36只SPFg鸟随机分成6组后，将pcDNA3.1-Omp-1与r-MOMP、CpG以不同组合进行两次免疫，以空质粒、免疫佐剂组做对照。二免后14天采血，以间接酶联免疫吸附试验(iELISA)和MTT法T淋巴细胞增殖(LTT)试验分别检测特异性抗体和淋巴细胞增值水平。二免14天后进行攻毒，攻毒后第7天采集泄殖腔棉拭子，免疫荧光抗体检测SPF鸡排除衣原体的状况；攻毒18天后，宰杀所有的SPF鸡，采集脾脏、肺脏，免疫组化染色观察清除禽鹦鹉热嗜性衣原体的状况。结果： ①获得重组质粒pcDNA3.1- Omp-1。经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段序列测定、比较，证实了重组质粒的正确性。 ②RT-PCR和Western-blot证实构建的重组表达质粒pcDNA3.1- Omp-1能够在哺乳动物细胞中表达：MOMP蛋白。 ③单独免疫r-MOMP能够诱发高水平的抗体，单独免疫pcDNA3.1- Omp-1能诱导中等水平的淋巴细胞增值。免疫DNA疫苗的鸡具有较好的衣原体清除效果，配合CpG2006免疫DNA疫苗组虽然只诱导了低水平的特异性抗体和中等水平T淋巴细胞增值，但其清除衣原体的效果最好。综上所述，本研究成功构建了禽鹦鹉热嗜性衣原体pcDNA3.1- Omp-1DNA疫苗，证实pcDNA3.1-Omp-1，疫苗具有较好的衣原体清除效果。CpG2006与DNA疫苗配合较单独免疫DNA疫苗组具有更好的衣原体清除效果，CpG2006具有增强鹦鹉热嗜性衣原体DNA疫苗的效果。

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作者
杨利;
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作者单位

中国农业大学;

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授予单位中国农业大学;
学科预防兽医学
授予学位硕士
导师姓名何诚;
年度 2007
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 S855.99;
关键词
鹦鹉热嗜性衣原体; 重组外膜蛋白; DNA疫苗; 免疫应答; 人畜共患病;

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