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DNA甲基化对斑马鱼gabrb2基因表达的调控：正常发育调控及在MET诱导构建的精神分裂症模型中的失调现象

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摘要

第1章 引言

1．1 精神分裂症的神经递质假说

1．2 GABA能系统的研究背景

1．3 DNA甲基化与精神分裂症表观动物模型的研究背景

1．4 利用斑马鱼研究GABA能系统及精神分裂症行为的可行性

1．5 本研究的目的

第2章 实验材料

2．1 实验动物

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 主要溶液配制

2．5 分析软件

第3章 实验方法

3．1 技术路线

3．2 斑马鱼的饲养

3．3 斑马鱼的集卵

3．4 整体原位杂交(Whole mount in situ hybridization，WISH)

3．5 药物处理(暴露)

3．6 行为学检测

3．7 酚／氯仿法DNA提取

3．8 Trizol法RNA提取

3．9 甲基化检测

3．10 mRNA表达检测

3．11 统计方法

第4章 实验结果

4．1 斑马鱼发育过程中全基因组和gabrb2启动子区的甲基化图谱

4．2 斑马鱼发育过程中gabrb2的mRNA表达图谱

4．3 MET暴露对斑马鱼精神行为的影响

4．4 MET暴露对斑马鱼全基因组和GABA能传递相关基因启动子区甲基化的影响

4．5 MET暴露对斑马鱼GABA能传递相关基因mRNA表达的影响

4．6 gabrb2基因启动子区甲基化与mRNA的表达的相关性分析

第5章 讨论分析

5．1 斑马鱼发育过程中全基因组甲基化是持续增高的

5．2 斑马鱼发育过程中gabrb2的表达受启动子区甲基化调控

5．3 斑马鱼发育过程中gabrb2表达的先减再增是为了适应与GABA递质的比例，以保障GABA能系统正常功能的行使

5．4 MET暴露可诱导斑马鱼产生精神分裂症模拟阴性症状和认知损害症状，用于构建精神分裂症模型

5．5 MET暴露破坏了斑马鱼gabrb2及gad1b正常表观调控，广泛升高GABA能系统各基因甲基化，与精神分裂症样阴性和认知损害症状有关

5．6 本研究的创新点、不足与展望

第6章 结论

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

声明

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摘要

目的：
　　精神分裂症(Schizophrenia)是一种影响思维、感觉、心境和社会性的复杂而严重的精神疾病，多在青壮年缓慢或亚急性起病，全球发病率接近1％。临床症状上由譬如幻觉、妄想、怪异行为的阳性症状，以及情感低落、快感缺乏、刻板思维、社交退缩等阴性症状构成，并可伴有认知功能损害症状。这些精神症状表现和神经系统功能往往是难以分开的，比如γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)能系统假说就认为，精神分裂症患者存在GABA能低下，精神分裂症恶化可能是GABA递质逐步缺乏的表现，且与精神分裂症阴性症状和认知损害症状相关。
　　GABA是脊椎动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，由谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）催化谷氨酸脱羧而合成，再经囊泡释放，激活突触后神经元细胞膜上的受体发挥作用，此外释放于细胞间的递质还需要由GABA运载体(GABA Transporter, GAT)及时再摄取，这整个过程称为GABA能的传递。突触后神经元细胞膜上的GABA受体有A、B两型，A型GABA受体属于离子通道型受体，是由a1-α6、β1-β3、γ1-γ3、ρ1-ρ3、π、ε、δ和θ多个亚基组成的五聚体复合物，其中a1、β2、γ2亚基是构成功能性受体的主要组分;介导GABA能快速突触反应。B型GABA受体属于G-蛋白耦合受体，是由GABBR1和GABBR2组成的二聚体复合物;介导GABA能缓慢突触反应。
　　在此GABA能的传递通路中，我们最关注的是编码GABA(A)受体β2亚基的GABRB2基因，并已经通过病例对照研究、细胞实验，及小鼠实验发现了其DNA多态性、mRNA表达异常、蛋白受体功能受损以及表观修饰异常都可能与精神分裂症有关;该通路中的GAD1，GAD2基因同样有着充足的精神分裂症易感性证据，三者均被收录于SZgene论坛数据库中;而GAT1基因作为编码脑内转运GABA的GAT蛋白最主要的基因，也有部分与精神分裂症相关的报道。
　　精神分裂症致病是由遗传和环境因素共同起作用，并由表观调控介导的。上述基因中，对GAD1基因的表观调控研究相对较多，有小鼠实验发现表观药物甲硫氨酸(L-Methionine，MET)暴露可诱导产生精神分裂症类似行为，并伴随着RELN和GAD1基因启动子区高甲基化改变，且通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(Valproate acid，VPA)干预，在逆转异常行为的同时降低了RELN的甲基化。而我们对GABRB2基因的前期实验结果也显示，在临床精神分裂症患者中，GABRB2基因内含子8和9上的疾病相关SNP存在基因印迹现象，是精神分裂症患者中出现基因型依赖性RNA表达降低的表观调控机制;此外我们还发现精神分裂症患者GABRB2基因启动子区存在显著的高甲基化现象。
　　我们希望通过本研究揭示模式生物斑马鱼中gabrb2基因的发育生物学信息，尤其是甲基化调控信息;再利用表观药物MET暴露构建斑马鱼精神分裂症行为学模型，并系统检测gabrb2基因（GABRB2同源基因）和其他联系紧密的GABA能传递通路基因(gad1b，GAD1同源基因;gad2，GAD2同源基因;slc6a1b, GAT1同源基因)的甲基化及表达改变，以期对模型背后机制进行解释，并进一步为精神分裂症发生或发展的监测、治疗药物的开发提供靶点。
　　方法：
　　1.实验动物:本课题所用野生型AB系斑马鱼，全部由南方医科大学发育生物学教研室提供;其中，6-18月龄的成鱼用于普通交配产卵;6-11月龄的成鱼用于药物处理及后续试验，并使雌雄比例均衡。
　　2.实验方法:
　　(1)斑马鱼的饲养:斑马鱼饲养在专门的鱼房中，参照Westerfield的方法进行。重要参数如下:鱼房昼夜光照周期为日∶夜=14∶10，反渗透净水机制备的养鱼系统水，保持pH值7.2-7.6，水温28.5-29.5℃，电导率450-550μs/cm。
　　(2)斑马鱼发育过程中甲基化图谱的构建:先进行限制性内切酶酶切，再结合荧光偏振的方法(FPDM)检测全基因组甲基化;结合荧光定量PCR的方法检测gabrb2基因启动子区甲基化。
　　(3)斑马鱼发育过程中gabrb2 mRNA表达图谱的构建:先提取总RNA后逆转录为总cDNA，再应用荧光定量PCR的方法检测。
　　(4)斑马鱼神经发育过程中gabrb2在脑组织内的定位:先需设计构建gabrb2基因的反义RNA探针，收集斑马鱼几个重要神经发育时间点的胚胎，以及6dpf之前的幼鱼，再使用整体原位杂交技术定位基因表达。
　　(5)斑马鱼成鱼药物处理:采用浸泡给药，所用表观药物MET参考Vuaden的实验，并增加了一个浓度，最终以低中高三个浓度:1.5mM，3.0 mM，6.0mM，以及不加药物的空白对照，连续处理7天，每天换药。
　　(6)斑马鱼行为学检测:进行了三种行为学实验，包括检测基本精神状况及自发运动的新鱼缸实验(Novel tank test)，检测社交行为检测的社交趋避实验(Social interaction test)，以及检测认知行为的T迷宫实验(T-maze tank test)。三种实验时间均需控制在当日光照后的4.5-9小时内进行(13:00-18:00)，实验开始前，先将受试鱼转移至行为学检测所用场地，并给予受试鱼30 min时间来适应周围环境。三种实验均采用先录制后分析的方式，前两种通过EthoVision2.1软件进行分析，T迷宫实验则由培训过的研究人员通过盲法人为分析。
　　(7)斑马鱼MET暴露后全基因组及GABA能传递相关基因的甲基化及mRNA表达分析:方法同发育过程中的相应检测，但基因除了gabrb2再加上gad1b, gad2和 slc6a1b。
　　3.统计方法:斑马鱼发育过程中全基因组甲基化、gabrb2基因启动子区甲基化和mRNA表达、新鱼缸实验、MET处理后各基因的启动子区甲基化和mRNA表达，依据方差齐性检验选用方差分析(ANOVA)或布朗分析(Brown-Forsytheanalysis)，并相应附以LSD或Dunnett T3的后检验;社交趋避实验、T-迷宫实验采用独立样本的t检验进行分析;甲基化和表达的相关性采用Spearman相关分析;p值小于0.05认为有统计学差异。
　　结果：
　　1.斑马鱼全基因组甲基化水平随着发育而持续增加，尤其是8-16hpf的神经系统发育早期，与0-4hpf的神经系统发育准备期相比，甲基化提升最明显，约增加了一倍，之后甲基化水平基本稳定，提升程度有限。
　　2.斑马鱼gabrb2基因启动子区甲基化水平随着发育而降低，检测的两个CCGG位点得到的结果均是如此，但距离转录起始点(TSS)-1336 bp位置的CCGG变化更明显。而斑马鱼gabrb2基因mRNA表达在发育初始有一短暂下调，随后持续升高，且成鱼比幼鱼要高很多，转折点在16 hpf-24 hpf间，且明显升高出现在2dpf后，即GABA能神经元出现，分泌GABA神经递质后。
　　3.整体原位杂交结果显示gabrb2从24 hpf开始，随着大脑形态分化，出现特异信号，定位于前脑、中脑、中脑后脑边界，2dpf开始在后脑也出现表达，且3 dpf-6 dpf斑马鱼大脑形态和gabrb2表达定位都非常稳定。
　　4.行为学实验显示，高剂量MET暴露诱发了斑马鱼社交障碍和学习记忆障碍，这是精神分裂症的核心阴性症状和认知损害症状的表现;并降低了斑马鱼的焦虑水平，但未改变其自发运动模式。
　　5.MET暴露广泛升高了全基因组和4个目标基因启动子区的甲基化水平，尤其是gabrb2-1336和gad1b-1397 CCGG位点。但即使是高剂量MET暴露，仍然未能引起GABA能传递系统4个目标基因mRNA表达显著下调。
　　6.相关分析显示，斑马鱼发育过程中gabrb2-1336 CCGG位点甲基化与其mRNA表达整体上呈负相关（尤其是经过表达转折点后），而MET暴露后相关性消失;gad1b-1397 CCGG位点甲基化受MET提升明显，与其表达同样不相关。
　　结论：
　　1.发育过程中，斑马鱼gabrb2启动子区（尤其是-1336 CCGG位点）甲基化总体上负向调控mRNA表达，尤其是GABA能神经元出现后。
　　2.高浓度MET暴露能在野生型AB系斑马鱼中模拟精神分裂症阴性症状和认知损害症状，以此构建精神分裂症模型。
　　3.gabrb2及gad1b的表观失调（主要表现在gabrb2-1336 CCGG位点和gad1b-1397 CCGG位点的甲基化失调），加上各GABA能传递相关基因启动子区的异常高甲基化，可能共同引起精神分裂症的阴性症状和认知损害症状发生。

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