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泌尿生殖道感染沙眼衣原体多态膜蛋白F基因的多态性研究

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前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 临床标本检测结果

2 PmpF PCR扩增结果

3 PmpF-RFLP 结果及多态性分析

4 PmpF序列测定及系统发育分析

5 血清型初步分析

6 菌株PmpF多态性与患者资料的相关性分析

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: 沙眼衣原体多态膜蛋白的研究进展

致谢

个人简历

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摘要

目的：泌尿生殖道沙眼衣原体的感染是世界范围内最常见的性传播疾病之一，其感染率已经超过淋病奈瑟菌，而跃居性传播疾病之首，在我国也有逐年上涨的趋势。与筛查或抗生素治疗相比，疫苗接种更经济，并对全球控制沙眼衣原体感染有更大的影响，因此普遍认为疫苗接种是降低沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,C.t)感染率的最好办法。目前，虽有大量关于衣原体的疫苗研究，但至今尚无成熟疫苗问世。目前亚单位疫苗及DNA疫苗的研究焦点是找到合适的抗原，现在研究比较多的抗原有主要外膜蛋白（Major Outer Membrane Protein，MOMP)，衣原体蛋白酶样活性因子（Chlamydial Protease-Like Activity Factor，CPAF）等，但这些疫苗均未达到理想的免疫效果。多态膜蛋白(Polymorphic Membrane Proteins， Pmp)是近年来发现的位于衣原体外膜上的一类蛋白，分子量比较大，而且具有型特异性，保守性好。同时研究发现，Pmp蛋白可能在C.t感染后粘附宿主细胞和机体免疫应答中具有重要功能，为研制疫苗的潜在抗原。因此本研究的目的是探讨泌尿生殖道感染患者沙眼衣原体多态膜蛋白 F（polymorphic Membrane Proteins F，PmpF）基因的多态性,为研究多态膜蛋白F作为沙眼衣原体候选疫苗提供理论依据。
　　方法：收集2013年1月~2014年12月某院泌尿科、妇科和皮肤科门诊泌尿生殖道感染患者送检的分泌物标本，并对患者的性别、年龄、标本来源进行详细登记。先用沙眼衣原体核酸诊断试剂盒进行初筛，将获得的沙眼衣原体阳性标本采用巢氏PCR扩增PmpF基因，然后将扩增得到的PmpF基因用Alu I、Hae III、Rsa I、Mob I四种内切酶进行酶切，酶切图谱采用Gelcompar II(version3.5)图像分析软件进行数据处理，用 Dice相似性系数和平均连锁聚类法进行聚类，得到 UPGMA树状图确定 PmpF基因多态性。根据PmpF-RFLP聚树结果，选择代表菌株测定其基因序列进行系统发育分析，进一步验证PmpF-RFLP聚树结果，同时测定代表菌株的OmpI序列并与参考菌株的序列比较，从而确定代表菌株的血清型。通过X2检验探讨沙眼衣原体PmpF基因型与患者性别、年龄和科室的关系。
　　结果：
　　12013年1月至2014年12月从妇科、泌尿科和皮肤科三个科室获得阳性标本178株。178株阳性标本中来自男性105个，占比为59％，来自女性73个，占比为41%；所有标本中来自妇科58个，占比为32.6%，来自泌尿科88个，占比为49.4%，来自皮肤科32个，占比为18%；阳性标本患者年龄分布为20岁以下8人，占比为4.5%，20~30岁之间为91人，占比为51.5%，30~40岁之间为59人，占比为33.1%，40~50岁之间的为19人，占比为10.1%，50~60岁之间的只有1人，占比为0.6%。
　　2通过巢氏PCR，178个阳性标本中有117个标本扩增获得PmpF基因，根据4种内切酶酶切图谱可以分为3个Type型，依次为Type1、Type2、Type3。3个Type型中，Type1有3株，占比为2.6%，Type2有43株，占比为36.8%，Type3有71株，占比为60.7%，Type3型占比最多，为本研究中优势菌株。选取了上述3个 Type型中的26株作为代表菌株，对其PmpF基因进行了序列测定并构建系统发育树，聚群结果与酶切聚树结果一致。
　　326株代表菌株OmpI序列测定，结果显示分别属于D、Da、E、F、G、H、J七种血清型。
　　4 X2检验结果表明：年龄与PmpF基因Type型具有相关性，性别、科室分布与PmpF基因Type型没有相关性。从年龄与PmpF基因Type型关系看，20岁以下患者中，Type2型最多，达到75%；20~30岁患者中， Type3型最多，占比为53.3%；30~40岁患者中，Type3型最多，占比高达82.9%；40~50岁患者中，Type3型也最多，占比为57.1%。
　　结论：
　　1从妇科、泌尿科和皮肤科三个科室泌尿生殖道感染患者标本中分离得到178株沙眼衣原体阳性标本，感染主要发生在20～50岁之间，其中感染率最高的年龄段为20～30岁。
　　2感染的沙眼衣原体血清型为D、Da、E、F、G、H和J七种血清型，与已有报道结果一致。
　　3 Alu I、Hae III、Rsa I、Mob I四种内切酶聚树将117株沙眼衣原体分为3个Type型，Type3占比为60.7%，为本研究中优势Type型。基于系。
　　结果：
　　12013年1月至2014年12月从妇科、泌尿科和皮肤科三个科室获得阳性标本178株。178株阳性标本中来自男性105个，占比为59%，来自女性73个，占比为41%；所有标本中来自妇科58个，占比为32.6%，来自泌尿科88个，占比为49.4%，来自皮肤科32个，占比为18%；阳性标本患者年龄分布为20岁以下8人，占比为4.5%，20~30岁之间为91人，占比为51.5%，30~40岁之间为59人，占比为33.1%，40~50岁之间的为19人，占比为10.1%，50~60岁之间的只有1人，占比为0.6%。
　　2通过巢氏PCR，178个阳性标本中有117个标本扩增获得PmpF基因，根据4种内切酶酶切图谱可以分为3个Type型，依次为Type1、Type2、Type3。3个Type型中，Type1有3株，占比为2.6%，Type2有43株，占比为36.8%，Type3有71株，占比为60.7%，Type3型占比最多，为本研究中优势菌株。选取了上述3个 Type型中的26株作为代表菌株，对其PmpF基因进行了序列测定并构建系统发育树，聚群结果与酶切聚树结果一致。
　　326株代表菌株OmpI序列测定，结果显示分别属于D、Da、E、F、G、H、J七种血清型。
　　4 X2检验结果表明：年龄与PmpF基因Type型具有相关性，性别、科室分布与PmpF基因Type型没有相关性。从年龄与PmpF基因Type型关系看，20岁以下患者中，Type2型最多，达到75%；20~30岁患者中， Type3型最多，占比为53.3%；30~40岁患者中，Type3型最多，占比高达82.9%；40~50岁患者中，Type3型也最多，占比为57.1%。
　　结论：
　　1从妇科、泌尿科和皮肤科三个科室泌尿生殖道感染患者标本中分离得到178株沙眼衣原体阳性标本，感染主要发生在20～50岁之间，其中感染率最高的年龄段为20～30岁。
　　2感染的沙眼衣原体血清型为D、Da、E、F、G、H和J七种血清型，与已有报道结果一致。
　　3 Alu I、Hae III、Rsa I、Mob I四种内切酶聚树将117株沙眼衣原体分为3个Type型，Type3占比为60.7%，为本研究中优势Type型。基于测序的系统发育树也证实了以上的分型结果。
　　4 PmpF基因Type型与性别、科室分布无关，而与年龄具有相关性，20岁以下患者中，Type2型最多，20岁以上患者中，Type3型为优势型。

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