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【6h】

p38MAPK信号通路在胰腺癌uPA表达及其在阿霉素诱导胰腺癌细胞侵袭、凋亡中的作用

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英文缩略词表

前言

第一部分

第一节uPA uPAR在胰腺癌中的表达

论文摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二节p38MAPK在胰腺癌中的表达

论文摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分p38MAPK在胰腺癌BxPC-3细胞株中表达uPA作用的研究

论文摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分阿霉素诱导胰腺癌BxPC-3细胞侵袭、凋亡过程中p38MAPK表达的研究

论文摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

研究小结

参考文献

综 述胰腺癌转移分子指标的研究进展

附 录

致 谢

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摘要

第一部分 第一节:uPA、uPAR在胰腺癌中的表达 目的:探讨尿激酶型纤溶酶原激活剂(UrokinasePlasminogenActivator,uPA)、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(UrokinasePlasminogenActivatorrecepteruPAR)在胰腺癌中mRNA及蛋白水平的表达，及其表达同胰腺癌的临床病理之间的关系，以探讨UPA和UPAR在胰腺癌侵润及转移中的意义。 方法:用RT-PCR检测UPA和UPAR在85例胰腺癌组织中有转移的癌组织及无转移的癌组织mRNA表达水平，并对上述结果进行图像分析以确定各组标本相对密度，t检验各组差异，以比较有转移和无转移的胰腺癌组织uPA和uPARmRNA水平的差异。利用组织芯片技术和免疫组织化学技术相接合在85例胰腺癌组织切片标本中检测癌组织，癌旁组织，淋巴结中uPA和uPAR的蛋白表达水平，并同胰腺癌临床病理之间做比较，以确定uPA和uPAR的蛋白表达与那些胰腺癌临床病理有关。 结果:uPAmRNA在胰腺炎中表达为0.236±0.067，在不伴有转移的胰腺癌中表达为0.639±0.052，胰腺癌中伴有转移者为1.064±0.082。uPARmRNA在胰腺炎中表达0.463±0.0374，在不伴有转移的胰腺癌中表达为0.692±0.0451，胰腺癌中伴有转移者为1.105±0.076。胰腺癌组织中uPA和uPAR的表达明显高于胰腺炎组织的表达(p＜0.05)，有转移的癌组织比无转移的高(p＜0.05)。uPA在85例胰腺癌组织中蛋白表达阳性率为69.41％，85例癌旁组织中表达阳性率为7.06％，75例淋巴结中表达阳性率为45.33％，69例有转移的胰腺癌组织中表达阳性率为76.81％。uPAR在85例胰腺癌组织中蛋白表达阳性率为72.94％，85例癌旁组织中表达阳性率为4.71％，75例淋巴结中表达阳性率为49.33％，69例有转移的胰腺癌组织中表达阳性率为81.16％。u-PA和u-PAR的表达与性别，年龄，肿瘤部位，肿瘤大小，肿瘤病理类型，TNM分期无关，与有无淋巴结转移和有无侵润转移有关(p＜0.05)。 结论:uPA和uPAR是反映胰腺肿瘤进展和生物学特性的指标，是临床上判断预后的良好指标之一。 第二节:p38MAPK在胰腺癌中的表达 目的:探讨丝裂原活性蛋白激酶(mitogen-activedproteinkinase，MAPK)的家族重要成员p38MAPK在胰腺癌中的蛋白表达，及分析p38MAPK表达同胰腺癌的临床病理之间的关系，以探讨p38MAPK在胰腺癌的发生，发展中的作用。 方法:利用组织芯片技术同免疫组织化学技术相接合在85例胰腺癌组织切片标本中检测癌组织，癌旁组织，淋巴结中p38MAPK蛋白表达水平，并同胰腺癌临床病理之间做比较，以确定p38MAPK蛋白表达与那些胰腺癌临床病理有关。 结果:p38MAPK阳性表达于胰腺癌细胞的细胞核内，少数位于胞浆内，p38MAPK在85例胰腺癌组织中蛋白表达阳性率为85.88％，85例癌旁组织中表达阳性率为21.18％，但其染色明显较癌组织为淡。在85例总的淋巴结中表达阳性率为42.35％，而在69例有转移的淋巴结组织中表达阳性率为46.38％，在16例无转移的淋巴结中阳性表达率为25％。p38MAPK的表达与性别，年龄，肿瘤部位，肿瘤大小，肿瘤病理类型，组织分化无关，在有淋巴转移的癌组织中p38MAPK表达高于无淋巴转移的癌组织(X2=4.237p=0.04)，在有侵润转移的癌组织中p38MAPK表达高于无侵润转移的癌组织(X2=6.586p=0.01)。 结论:信号分子p38MAPK信号转导分子通路的改变在胰腺癌的发展中起了一定作用，是反映胰腺肿瘤进展和生物学特性的指标，是临床上判断预后的指标之一。 第二部分:p38MAPK在胰腺癌BxPC-3细胞株中表达uPA作用的研究 目的:探讨p38MAPK(p38mitogen-activedproteinkinase)信号通路在人胰腺癌细胞表达尿激酶型纤溶酶原激活剂(UrokinasePlasminogenActivator,uPA)中的作用，以及p38MAPK信号通路在人胰腺癌细胞体外侵袭中的作用。 方法:用Westernblotting和RT-PCR法分别检测BxPC-3和Aspc-1胰腺癌细胞株中p38MAPK和uPA的表达，蛋白激酶活性实验观察BxPC-3细胞p38MAPK抑制剂SB203580对BxPC-3细胞内p38MAPK活性的影响，RT-PCR观察p38MAPK抑制剂SB203580对BxPC-3细胞uPA表达的影响，细胞侵袭实验观察p38MAPK抑制剂SB203580对BxPC-3胰腺癌细胞株的侵袭作用。 结果:uPAmRNA在BxPC-3、Aspc-1两株细胞株中分别是0.162±0.008和1.090±0.014，两比较差异显著。Westernblotting检测检测两种胰腺癌细胞p38MAPK和phosph-p38MAPK，BxPC-3细胞株和Aspc-1细胞株都有p38MAPK蛋白的表达，但Aspc-1细胞株表达较弱。BxPC-3细胞株内源性p38MAPK蛋白高活性表达，而Aspc-1细胞株内源性p38MAPK蛋白活性的表达很低。Matrigel细胞侵袭力实验，胰腺癌BxPC-3和Aspc-1细胞穿膜细胞的数目分别为353.33±12.78，155.66±9.72，差异有显著性。细胞体外侵袭实验结果表明，给予20umol/L、10umol/L、5umol/L、2umol/L、1umol/Lp38MAPK抑制剂SB203580后BxPC-3细胞的细胞穿膜细胞的数目为267.33±9.71、272.00±17.35、324.33±20.60、340.33±16.04、338.33±10.97，对照组细胞穿膜细胞的数目为353.33±12.67，采用单因素方差分析F=18.186，组间比较10umol/L、20umol/LSB203580治疗组同其他组差异显著，侵袭显著减少。10umol/LSB203580可抑制80％的Hsp27(MAPKAPK-2的一种底物)的磷酸化,20umol/LSB203580可抑制90％的Hsp27的磷酸化。SB203580对p38MAPK和MAPKAPK-2的表达无影响。给予1umol/L、2umol/L、5umol/L、10umol/L、20umol/Lp38MAPK抑制剂SB203580，BxPC-3细胞株uPAmRNA的表达分别为1.079±0.002、1.075±0.013、0.996±0.129、0.872±0.075、0.839±0.134。采用单因素方差分析F=5.517，10umol/L、20umol/Lp38MAPK抑制剂SB203580干预组同其他组相比，差异显著。 结论:p38MAPK信号通路在胰腺癌BxPC-3细胞侵袭转移中具有重要作用；p38MAPK信号转导途径可以诱导人胰腺癌BxPC-3细胞表达uPA。 第三部分:阿霉素诱导胰腺癌BxPC-3细胞侵袭、凋亡过程中p38MAPK表达的研究 目的:研究阿霉素诱导胰腺癌细胞凋亡过程中p38MAPK表达的变化，探讨p38MAPK在其中的作用，并探讨阿霉素抑制胰腺癌细胞侵袭力的影响，及其发生机制。 方法:用AnnexinV-PI染色及流式细胞技术分析阿霉素及应用p38MAPK抑制剂SB203580对胰腺癌细胞凋亡的影响，同时利用免疫细胞化学法观察经阿霉素及SB203580处理人胰腺癌BxPC-3细胞后，p38MAPK的表达水平；用Boyden小室检测经阿霉素及SB203580处理后胰腺癌BxPC-3细胞的侵袭力。 结果:SB203580(20umol/L)干预组胰腺癌BxPC-3细胞凋亡率为20.1±1.35％，阿霉素作用24h后诱导胰腺癌BxPC-3细胞凋亡，凋亡率为31.10±2.73％，加用SB203580抑制p38MAPK通路后可增强阿霉素诱导的凋亡作用，凋亡率达40.4±2.57％。采用单因素方差分析F=136.79，组间比较组与组之间差异显著。以20umol/L阿霉素作用BxPC-3胰腺癌细胞24h后可见p38MAPK在细胞染色后呈现深褐色颗粒散在分布于部分或整个细胞核及细胞浆内，联合应用SB203580后可见p38MAPK表达颗粒密度减低，数量减少。Boyden小室实验：细胞株内分别加入阿霉素(20umol/L)，SB203580(20umol/L)及合用阿霉素(20umol/L)与SB203580(20umol/L)与细胞共同孵育24h后细胞的细胞穿膜细胞的数目为267.33±9.71、285.25±9.71、255.67±14.05，对照组细胞穿膜细胞的数目为353.33±12.67，采用单因素方差分析F=24.718，组间比较加入阿霉素(20umol/L)加SB203580(20umol/L)组后细胞穿膜数目比单用阿霉素(20umol/L)细胞穿膜数目明显减少(p=0.028)。 结论:阿霉素可以活化p38MAPK通路，p38MAPK可能起到保护胰腺癌BxPC-3细胞逃避阿霉素诱导的凋亡，阻断该通路可增强阿霉素诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。p38MAPK抑制剂SB203580可以抑制阿霉素对胰腺癌细胞侵袭力。

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