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全反式维甲酸增强前列腺癌自杀基因治疗的旁观者效应及其与连接蛋白43的关系

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研究背景

第一部分全反式维甲酸对前列腺癌细胞生长及其连接蛋白43表达的作用

第二部分全反式维甲酸对Ad-TK/GCV系统治疗前列腺癌旁观者效应的影响

第三部分ATRA增强Ad-HSV-TK/GCV系统治疗荷前列腺癌裸鼠效果的研究

总结

攻读学位期间公开发表的论文

主要缩略词表

致谢

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摘要

本研究以雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC．3作为研究对象，应用ATRA来处理，了解其生长抑制效果以及与Cx43蛋白表达的关系；同时，在体内外实验中，探讨ATRA能否增强Ad-HSV-TK(简称Ad-TK)／GCV系统治疗PC-3细胞的旁观者效应。 方法：PC-3细胞培养在含10％胎牛血清的RPMll640培养液中，以终浓度为10'Smol／L．10'4mol／L的ATRA来处理，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞生长抑制率，并在光学显微镜下观察形态学改变；同时，应用Westernblot检测ATRA处理前后PC-3细胞Cx43蛋白的表达水平，流式细胞仪测定Cx43阳性细胞率，免疫组织化学SABC法来显示Cx43蛋白在细胞上表达的位置和表达强度。流式细胞仪测定Ad对PC-3细胞感染率为100％时的感染复数(MOI)。MTT法评价不同浓度GCV对PC-3细胞的毒性。MTT法检测Ad-TK／GCV系统对PC-3细胞的杀伤力和旁观者效应，以及联合应用ATRA是否增强旁观者效应，同时采用析因分析法分析ATRA对Ad-TK／GCV系统旁观者效应的影响。建立26只荷前列腺癌裸鼠模型，以联合应用ATRA与否来分为实验组和对照组，各13只。实验组和对照组再分为PBS／GCV组(3只)和Ad-TK／GCV组(10只)，定期观察药物副作用，并记录肿瘤体积的变化。治疗35天后处死所有荷瘤裸鼠，组织标本行常规病理学检查和RT-PCR检测TK基因。 结果：ATRA可以抑制PC-3细胞生长，当终浓度≥10-6mol／L时，明显降低细胞存活率，形态学上主要以细胞凋亡形式出现；当终浓度≤10-Tmol／L时，无抑制细胞生长作用。ATRA抑制PC-3细胞生长呈浓度．时间依赖性(P<0．05)。Westernblot结果显示PC-3细胞仅有微弱Cx43蛋白表达，随着作用时间延长和浓度增加，Cx43蛋白条带显色同步增强。流式细胞仪检测显示Cx43阳性细胞数增多，从10％上升至83．6％，与ATRA的关系也呈现时间一浓度依赖性(P<0．05)。免疫组织化学SABC法显示，ATRA未处理时，Cx43蛋白在胞膜中和胞浆中微弱显色；经ATRA处理后，Cx43蛋白在胞膜和胞浆中均大量表达，但以胞膜为主。在MOl200时，第3天和第5天流式细胞仪检测显示，PC-3细胞被Ad感染的细胞数均稳定在100％。GCV终浓度≤100umol／L时，对PC-3细胞无毒性；而≥1000umol／L时，则显著降低细胞生存率(P<0．05)。Ad．TK／GCV系统对PC-3细胞有一定的杀伤作用，旁观者效应在TK+：TK-细胞混合比例为5：5时明显出现(P<0．05)；加用ATRT后，在TK+：TK。细胞混合比例为3：7时就明显出现(P<0．05)。ATRA与Ad-TK／GCV系统治疗PC-3细胞旁观者效应进行析因分析发现，二者有相关性(P<0．05)。PC一3细胞致瘤性强，出瘤率达100％(5／5)。体内治疗的对照组和治疗组中，Ad-TK／GCV组抑制肿瘤生长均明显强于PBS／GCV组(P<0．001)。比较治疗组和对照组，PBS／GCV组之间肿瘤生长抑制无明显差别(P>0．05)；而Ad-TK／GCV组之间治疗肿瘤的效果存在差异，治疗组在前3周抑制肿瘤生长明显强于对照组(P<0．05)，但3周后差异无统计学意义(P>0．05)，而且2只裸鼠的肿瘤反而长得更快、更大。明显疗效出现时间上也存在差异，治疗组提前1周发挥显著抗肿瘤作用。治疗第5周结束时，在肿瘤完全消退率上，治疗组为60％(6／10)，而对照组仅为40％(4／10)。 结论：在浓度为≥10-6mol／L时，ATRA可以显著抑制PC-3细胞的生长，呈时间一浓度依赖性。ATRA降低PC-3细胞存活率的主要作用机制可能是细胞凋亡。PC-3细胞上Cx43蛋白表达少，不能形成有效的GJ，因此恶性程度高。ATRA可以提高Cx43蛋白的表达量，主要分布在胞膜，从而形成功能性GJ，抑制细胞生长；同时，可以提高Cx43蛋白阳性细胞数，也呈时间一浓度依赖性。在MOl200时，Ad对PC-3细胞转染率稳定在100％。GCV浓度≥1000ug／ml时，对PC-3细胞有毒性；而≤100ug／ml时，无毒性。ATRA明显提高Ad-TK／GCV系统治疗PC-3细胞的旁观者效应，达到50％细胞生存抑制率时可以减少TK+细胞用量的20％：析因分析证实，ATRA与旁观者效应有交互作用。体内实验方面，治疗组和对照组中，Ad-TK／GCV组均明显抑制肿瘤生长。ATRA可以提高Ad-TK／GCV抑制肿瘤生长作用，而且可以提前1周发挥显著抗肿瘤作用；治疗后期缺乏明显差异，可能与样本量少有关。另外，ATRA还可以提高Ad-TK／GCV系统的肿瘤完全消退率。治疗组中，部分肿瘤在治疗后期生长反而快，可能是瘤体内其它促肿瘤生长因素被激活，或对ATRA产生耐药等。

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