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新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时血管内皮生长因子表达与新生血管形成关系的研究

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综 述血管内皮生长因子在脑组织中的表达

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摘要

目的：新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)是新生儿时期的常见病，缺氧缺血是HIBD后造成脑神经组织损伤的主要因素。围生期窒息时，脑组织经历缺氧-缺血-再灌注损伤或持续低灌注的病理生理过程，从而影响脑的结构和功能，导致脑损伤，由此可见，缺氧缺血后脑组织血运供应的改善与神经元功能的恢复密切相关。血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族是一组近年来新发现的血管新生因子，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盘生长因子(PIGF)六大成员，近年来的研究表明，VEGF具有如下重要作用：(Ⅰ)调节生理和病理的血管和淋巴管的再生；(2)对外周和中枢神经系统的神经营养和神经保护作用，并直接作用于神经元、神经髓鞘细胞，星形细胞、神经干细胞和胶质细胞；(3)调节神经再生；许多研究证明VEGF家族在成人脑血管疾病中发挥着重要作用，但有关VEGF在正常新生儿及缺氧缺血性脑损伤(HIBD)时脑组织中的分布和表达及脑组织新血管形成的研究甚少。本研究通过新生大鼠HIBD动物模型，动态观察正常生后7日龄新生大鼠及HIBD后不同时间脑VEGF蛋白的表达和分布以及HIBD后血管新生情况，并探讨HIBD时脑皮质VEGF蛋白表达与血管新生之间的相互关系。 材料与方法：1.动物实验部分正常生后7日龄新生Wistar大鼠176只，性别不限，体重9-18克，由中国医科大学动物实验中心提供，随机分成实验组和对照组，实验组88只分为HI后0、4、8、12、24、48、72小时和7、14、21、28天组，每组8只；对照组88只，按上述时间点分组，每组8只。参照文献[1]制作HIBD模型。 (Ⅰ)HIBD组：分离并结扎右侧颈内动脉，后将大鼠置于氧浓度为5％、氮气浓度为95％的密闭容器中(500mm3进入气体的流速5L/min)，持续时间20分钟。 (2)对照组：仅分离右侧颈内动脉不予结扎和缺氧。(3)标本采集：在缺氧缺血(HI)后不同时间点(0、4、8、12、24、48、72小时和7、14、21、28天)同时处死实验组和对照组大鼠，取脑固定，脱水，透明后浸蜡。 2.实验方法(Ⅰ)石蜡切片HE染色。(2)应用免疫组织化学染色检测VEGF蛋白在正常生后7日龄新生大鼠及HIBD后不同时间点的脑组织中的分布及表达情况：标本为脑组织石蜡切片，抗原行微波加热修复，进行SABC染色，DAB显色，苏木素复染。(3)FⅧ-Rag的免疫组织化学检测新生血管。 3.结果判定(Ⅰ)VEGF蛋白表达：400倍光镜下观察实验结果，阳性表达的细胞浆呈棕黄色，胞核为蓝色淡染。 (2)新生血管表达：阳性产物定位于血管内皮细胞胞浆，胞核为蓝色淡染。 4.统计学分析(1)400倍光镜下每组每个时间点各随机抽取8张切片，每张切片取5个高倍视野(脑皮质区)，经日本产的OLYMPUSBX51TF数码相机采样，用图象分析系统选取阳性细胞着色率达90％以上时红黄蓝达到的色差百分比作为标准，经metamorph软件测定其光强度(OD值)作为VEGF蛋白的相对含量，将所得的OD值占总面积百分比作为标准进行比较；(2)新生血管计数方法参照文献[2]；(3)所有数据以平均值±标准差值((x)±s)表示，统计学分析采用t检验，等级相关分析方法，P＜0.05有意义。 结果一、脑组织病理学观察：显微镜下观察：对照组大脑未见脑损伤形态学上的改变；模型组HI后0小时即可见灶状出血，12小时神经细胞及间质水肿明显，12h-24h时脑皮质微血管可见明显扩张，72小时有软化灶及胶质增生小结出现，7天仍可见坏死病变。 二、新生大鼠脑组织内VEGF蛋白表达动态变化：1.正常新生大鼠脑皮质VEGF蛋白的表达：正常新生大鼠生后第7天于脑组织多种细胞的胞浆中即可见VEGF表达，并集中于皮层和海马，亦可见于髓质、软脑膜、脉络丛和血管内皮细胞，于第8天表达水平增多，第9天达高峰，以后逐渐降低，持续至生后第35天。 2.HIBD后新生大鼠脑皮质VEGF蛋白的表达：VEGF在HIBD大鼠脑组织中的表达定位与正常大鼠基本相同，于HI后0小时即可见表达，于HI后4小时表达逐渐增加，于48小时达高峰后逐渐下降，可持续至HI后28天，并且于HI后4小时-14天时间点VEGF表达显著高于对照组并具有统计学意义。 三、HIBD后脑皮质血管新生的动态观察：皮层区可见各时间点正常新生大鼠脑组织新生毛细血管数变化不大，平均约3-8条/HP；而HIBD模型组于HI后3天-28天的新生血管数显著多于对照组(P＜0.01)，血管新生高峰期为HI后3-7天，以后一直持续较高水平。 四、于HI后0-72小时VEGF表达程度与新血管形成之间呈显著正相关。 结论1.正常生后7-35日龄新生大鼠脑组织内有不同程度的VEGF蛋白表达。 2.HI可诱导VEGF蛋白的表达，表达部位与正常新生鼠脑VEGF蛋白表达部位相同，但表达强度增强，高表达持续时间延长。 3.新生大鼠HIBD后脑组织有新血管形成，血管新生高峰期为HI后3-7天。 4.于HI后0-72小时VEGF表达程度与新生血管形成之间呈显著正相关。

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