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含对虾白斑综合症病毒ie1启动子的重组杆状病毒介导的哺乳动物细胞基因转移

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第一章 文献综述

综述一昆虫杆状病毒表达系统

1杆状病毒简介

2杆状病毒表达载体系统的特点

3 Bac-to-Bac表达系统

4杆状病毒表达系统所用启动子的类型

5昆虫杆状病毒表达载体系统的研究及应用

综述二重组杆状病毒作为哺乳动物细胞基因递送载体

1杆状病毒进入哺乳动物细胞

2杆状病毒的转导机制

3影响杆状病毒对哺乳动物细胞转导效率的因素

4杆状病毒介导的体外基因转移

5杆状病毒介导的体内基因传递

第二章 研究报告

1材料与方法

1.1主要仪器和试剂

1.2菌株、质粒和细胞

1.3重组转移载体的构建及鉴定

1.4重组杆粒的获得及鉴定

1.5重组杆状病毒的获得与鉴定

1.6哺乳动物细胞的转导

1.7哺乳动物细胞的瞬时转染

1.8利用流式细胞仪检测报告基因EGFP的表达

2结果

2.1目的片段的获得

2.2重组转移载体的获得及酶切鉴定

2.3重组杆粒的PCR鉴定结果

2.4重组杆状病毒的PCR鉴定

2.5含有不同启动子的重组杆状病毒在sf9细胞中的活性

2.6 WSSV ie1启动子在哺乳动物细胞中同样具有活性

2.7丁酸钠可增强WSSV ie1启动子在哺乳动物细胞中的基因转移和表达效率

2.8 WSSV的ie1启动子在哺乳动物细胞中的活性是杆状病毒非依赖性的

3讨论

第三章结论

参考文献

致谢

作者简历

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摘要

随着携带哺乳动物细胞启动子的重组杆状病毒逐渐成为基因功能研究、非复制型载体疫苗研制以及开发基因治疗策略的一个非常有效的工具,寻找一种在昆虫细胞和哺乳动物细胞之间的穿梭启动子对于杆状病毒介导的基因转移方面的研究非常必要。 在本研究中,我们利用对虾白斑综合症病毒 (white spot syndrome virus,WSSV) 的iel启动子和杆状病毒ETL启动子以及杆状病毒多角体启动子,分别构建了含有不同启动子调控下的EGFP报告基因表达盒的重组杆状病毒,然后转导不同哺乳动物细胞,以检测不同启动子在细胞中的转导和表达效率。结果显示,WSSV的iel启动子在昆虫细胞sf9中具有很强的启动子活性,能够控制报告基因的高效表达,同时在哺乳动物细胞中,iel 启动子与 ETL 启动子一样在不同哺乳动物细胞中均有活性,能够介导EGFP不同水平的表达,并且丁酸钠能够提高iel启动子在哺乳动物细胞中的转导和表达效率。转移载体瞬时转染结果证实,iel启动子能够直接启动外源基因在哺乳动物细胞中的表达,而不依赖于杆状病毒基因表达。 本研究首次发现iel是一种杆状病毒非依赖性、在昆虫细胞和哺乳动物细胞之间的新型穿梭启动子,该穿梭启动子对于杆状病毒表达载体在基因治疗和非复制型载体疫苗方面的研究将具有重要应用价值。

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