CADASIL病人中SHP基因新SNP致其功能结构改变及意义的研究

代理获取

页面导航

目录
摘要
著录项
相似文献
相关主题

摘要

研究背景：伴有皮层下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)是一种家族遗传性非动脉硬化性、非淀粉样变性脑血管病。患者中年起病，以反复缺血性脑卒中发作、进行性加重伴智力障碍等为临床特征。1993年将此病的基因定位在第19号染色体短臂，1996年确定本病有基因缺陷，为NOTCH3基因错义突变，而90％的CADASIL患者均存在基因突变。CADASIL病部分是由Notch3受体突变引起的。Notch3突变而导致的CADASIL发病的可能的机制是，认为Notch3结合配体后，受体胞内域进入细胞核传导信号，而胞外域可因蛋白分解而导致被清除。而未降解的Notch3胞外域可能是嗜锇颗粒GOM的主要成分。CADASIL病人中胞外域沉积成GOM，可能抑制平滑肌的正常代谢。但是Notch3蛋白在发病中机制如何，而有部分CADASIL临床表现的病人未见到明显的Notch3基因的突变，有否其他突变类型?是否可能通过其他机制发病?如何早期诊断和干预？都值得我们深入研究。
　　目的：筛选SHP基因的突变，以及分析突变所导致的SHP蛋白结构和功能改变。探讨CADASIL病人中SHP基因的甲基化状态。从而探讨SHP基因突变以及甲基化状态在CADASIL发病中的可能作用机制。
　　方法：
　　 ⑴所有标本均来源于西班牙Asturias中心大学医院神经与分子遗传学系。使用高保真酶PCR扩增片段以及直接测序法筛选SHP基因的外显子、内含子、启动子以及侧翼序列。
　　 ⑵提取人脑组织总RNA为模板进行RT-PCR得到SHPcDNA全段，随后使用高保真酶扩增。扩增后片段克隆至pGEM-T Easy载体，测序验证目的片段序列完全正确。使用EcoRⅠ，XbaⅠ酶切位点，分别将全长基因片段亚克隆到pcDNA3.1-GFP与pCMV-Flag真核表达载体中，通过KpnⅠ，XbaⅠ酶切位点将SHPcDNA克隆至VP-16载体上。通过基于聚合酶链反应的定点突变方法产生含突变的SHP基因表达质粒。使用lipofectamine2000进行细胞质粒转染。
　　 ⑶将质粒Flag-SHPWT，Flag-SHPR38H，Flag-SHPK170N和Flag-SHPG171A与HA-Ubiquitin真核表达质粒共同转染Hela细胞后，再用5μM的MG132(Cayman)进行处理。24小时后用500μM裂解液，裂解并收集细胞。并加入抗FLAG M2磁珠(sigma公司)在4℃，孵育4小时进行免疫沉淀。使用裂解液将磁珠洗三遍后，使用抗体anti-HA(Sigma公司)和anti-FLAG(Sigma公司)，WB法分别检测泛素蛋白以及SHP蛋白的表达量。
　　 ⑷将质粒Flag-SHPWT Flag-SHPR38H，Flag-SHPK170N and Flag-SHPG171A和HA-Ubiquitin转染Hela细胞24小时后，再用0.2μM TSA进行处理2小时，用裂解液裂解，获得全细胞提取液。用抗FLAG M2磁(sigma公司)在4℃。孵育4小时进行免疫沉淀。再用裂解液将磁珠洗三遍。免疫沉淀蛋白的Western blots检测使用抗乙酰化赖氨酸(acetylated-lysine)抗体和抗FLAG抗体。
　　 ⑸使用Promega公司的CheckMateTM哺乳动物双杂交系统试剂盒，使用pG5-luc荧光素酶报告基因系统检测。
　　 ⑹Flag-SHPWT,Flag-SHPR38H，Flag-SHPK170N和Flag-SHPG171A的体外蛋白合成是按照厂商指示使用T7启动子的TNT-T7快速偶联转录/翻译系统进行表达。GST融合蛋白的获得是通过GST，GST-ERRγ，GST-LRH1，GST-HNF4α,或GST-EID1等在大肠杆菌BL21/DE3/RIL的表达而实现的。洗掉非特异性结合的蛋白后，即对用WB检测分析捕获蛋白。
　　 ⑺所有的分子动态模拟(MD)都是使用Desmond2.2软件完成。野生型SHP的同源性模型是基于与之有相似序列的超螺旋蛋白(USP，pdb code lg2n)而构建的。SHPK170N和SHPG171A突变模型的产生是通过在SHPWT结构上分别用天门冬胺酸(aspargine)和丙氨酸(alanine)替代Lys170，Gly171残基而实现的。
　　 ⑻使用EZ DNA Methylation-GoldTM试剂盒进行DNA的亚硫酸盐(Bisulfite)转化，纯化回收样本设计引物进行扩增测序。
　　 ⑼统计分析由软件SPSS13.0 for Windows完成。资料的所有数值均以均数±标准差表示，应用单因素方差分析或student's T检验进行统计分析，显著性检验水准为p＜0.01。
　　结果：
　　 ①正常组以及CADASI各组病人中发现了3个杂合子非同义SHP基因的SNP，其中两个新的错义突变(p.R38H，p.K170N)和一个以前报道过的突变(p.G171A)，同时首先发现了4个内含子或肩动子杂合子突变。
　　 ②外显子突变p.R38H，p.K170N突变显示了SHP蛋白在核内转运受损。p.K170N使SHP对泛素化(Ubiquitination，Ub)介导的蛋白质降解更加敏感，并且阻断了SHP蛋白的乙酰化(Acetylation)，同时使其失去抑制雌激素相关受体(Estrogen related receptor-gamma，ERRγ)和肝细胞核因子(Hepatocytenuclear factor-4α，HNF4α)的作用，而不影响对肝受体类似物-1(Liverreceptor homolog-1，LRH-1)的作用；而G171却增加了SHP基因mRNA和蛋白表达，并且SHP蛋白的抑制功能不受影响。基本上，突变的SHP与靶蛋白LRH1，E1A样分化抑制因子1(E1A-like inhibitor of differentiationl，EID1)的蛋白结合增强了。K170N明显损伤SHP，HNF4a，组蛋白去乙酰化酶1/3(HDAC1 histonedeacetylase1/3,HDAC1/3)与载脂蛋白CⅢ(apolipoprotein CⅢ，ApoCⅢ)启动子的结合。
　　 ③对SHP的分子动态模拟显示SNP突变p.G171A稳定了核受体盒，而突变K170N则促进了核受体的所有结构元素的构象失稳态。本研究显示SHP基因突变在人类普遍存在，p.K170N末端在控制与蛋白稳定相关的SHP泛素化和乙酰化过程中，以及改变其对转录激活的抑制作用中起扮演着重要角色。
　　 ④CADASIL样本中SHP基因启动子区域的甲基化水平稍高于对照组。
　　结论：SHP基因的单核苷酸多态性普遍存在于人类不同的组织中，发生的频率较高。我们发现的3个杂合子非同义SHP单核苷酸多态性SNP，其中两个新的错义突变(p.R38H，p.K170N)和一个以前报道的突变(p.G171A)，同时存在于病人及对照中，可能因为样本量少，没有发现显著性差异。有待于我们进一步加大样本量进行SHP突变与CADASIL关联性分析。内含子与3'UTR突变在CADASIL中相对较高。有意义的是大部分这些突变发生在含有Notch3突变的CADASIL病人当中(共11例)，在无Notch3突变的CADASIL病人当中只有一例，显示在发病过程中，SHP基因与Notch3之间可能存在潜在联系。小非编码RNA经常定位于基因的内含子，而mirRNA的靶点经常在3'端。现在不清楚是否这些突变改变了SHP的整体构象，阻断蛋白稳定或致使SHP失去功能，我们将在以后的研究中探索。

著录项

作者
周桃峰;
展开▼
作者单位

中山大学;

展开▼
授予单位中山大学;
学科神经病学
授予学位博士
导师姓名徐评议,Lee W.Van Eeden;
年度 2010
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R743.02;R361.3;
关键词
脑动脉病; 常染色体; 基因表达; 细胞病理学;

相似文献

中文文献
外文文献
专利

1. FⅧ基因内5个SNPs位点多态性对血友病A基因诊断的意义 [J] . 吴娴 ,周湘红 ,苏莉 . 重庆医学 . 2018,第015期
2. 5-杂氮-2′-脱氧胞苷对白血病K562细胞株SHP-1和JAK2基因表达的影响及意义 [J] . 闫俊红 ,刘建亮 . 山东医药 . 2010,第011期
3. 钙激活蛋白酶-10基因相关的SNP等位基因频率和单体型频率在汉族人中的分布及其与胰岛素敏感性的关系 [J] . 黄知敏 ,修玲玲 ,翁建平 . 中国糖尿病杂志 . 2004,第003期
4. 高血压病早期左房结构改变的意义及与心舒张功能的关系 [J] . 马彩娥 ,吕发勤 ,杜丽 . 中国超声医学杂志 . 1998,第011期
5. OAS1基因SNP对儿童手足口病易感性和疾病严重性的影响及临床意义 [J] . 吴柳松 ,徐洪波 ,何英 . 遵义医科大学学报 . 2021,第002期
6. SHP-1、JAK3、SOCS4与SOCS5基因在白血病细胞中的表达及其临床意义 [C] . 罗建民 ,刘晓蕾 ,葛韦 . 第11次中国实验血液学会议 . 2007
7. 白血病细胞SHP-1与SOCS3基因表达的相关性研究及甲基化抑制剂对SHP-1基因表达的影响 [A] . 李燕 . 2006

CADASIL病人中SHP基因新SNP致其功能结构改变及意义的研究

目录

摘要

著录项

相似文献

相关主题

期刊订阅