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乳腺癌患者腋窝前哨淋巴结CK19、MG的PCR检测——腋窝分期的快速辅助诊断方法及其价值研究

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摘要

研究背景：
　　 乳腺癌患者腋窝淋巴结的转移情况，直接影响着乳腺癌患者的10年复发率及生存率，所以腋窝淋巴结的转移情况是一个重要的预后判断指1。而前哨淋巴结(sentinel lymph node)，作为第一个接收原发乳腺癌区域淋巴引流的淋巴结2，其状态可以准确反映腋窝淋巴结是否出现淋巴结转移3。
　　 前哨淋巴结活检与腋窝淋巴结清扫对比，前哨淋巴结状态可判断腋窝分期。前哨淋巴结的病理检查效能已经提高，更多的淋巴结微小转移灶(MICmicrometastases＞0.2mm to2mm)及孤立肿瘤细胞(ITC Isolated Tumor Cell≤0.2mm)可以被检出。Reed J等人4对进行过前哨淋巴结活检的的病人10年的回顾性研究中发现，MIC与病人的非前哨淋巴结阳性和远处转移是有相关性的，而ITC则没有相关性。ITC在最新病理学分类中归于淋巴结阴性，MIC则定义为淋巴结阳性5。所以前哨淋巴结检测为MIC的病人，需要积极的乳腺癌术后辅助治疗4。所以快速辅助珍断淋巴结大于0.2mm的前哨淋巴结转移，可以帮助外科医生判断患者腋窝分期，从而决定手术方式，及后续辅助治疗。
　　 我中心乳腺癌病的保乳包腋窝手术在国内处于领先水平，有近50％的病人采用保乳手术及前哨淋巴结活检进行治疗。在术中将肿物，肿物残腔边缘及SLN送术中冰冻活检，根据肿物边缘情况及SLN情况决定是否进行乳腺痛改良根治术及腋窝淋巴结清扫术。SLN术中冰冻，一般取淋巴结最大径切片，行HE染色镜检。Takei H等7在队列研究中发现，术中冰冻的假阴性率为11.7％。现有的冰冻切片技术，因为敏感性低，在活检过程中，往往可以导致50％的淋巴结组织丢8，术中冰冻出现假阴性，术后病理若为阳性时，会导致二次手术以及医疗费用增高，同时也增加了患者的精神压力及经济负担。因此，我们需要一个更可靠的检验方式，作为术中冰冻的辅助参考指标，减小术中冰冻假阴性率，提高SLNB的阳性检出率，以减少二次手术率。
　　 随着科学和技术的发展，采用对细胞特异的信使RNA逆转录后进行扩增的实时定量逆转录聚合酶链技术(Q-RT-PCR)，我们可以提高肿瘤基因的检测的敏感性。理想的乳腺肿瘤标记物应为特异性、敏感性高，同时为前哨淋巴结中并不表达的基因。
　　 该实验检测CK19及MG作为淋巴结阳性的肿瘤标汜物，以淋巴结的病理连续切片为金标准，检测淋巴结转移灶＞0.2mm(MIC)的敏感性和特异性，及其阳性预测值和阴性预测值。PBGD(Porphobilinogendeaminase，胆色素原脱氨酶)作为前哨淋巴结的看家基因，选为该试验的内部质控。
　　 研究目的：
　　 本试验的主要目的是评价CK19和MG的PCR检测，在判断乳腺癌患者腋窝前哨淋巴结状态的敏感性和特异性。
　　 本试验的次要目的是评CK19和MG用于乳腺癌患者腋窝前哨淋巴结状态检测的阳性预测值和阴性预测值。
　　 材料与方法：
　　 一、样本资料
　　 入组条件：1、确珍乳癌病人并计划手术进行SLNB者；2、年龄≥18岁，男性或女性；3、签署临床实验知情同意书者(OCD-200804)
　　 排出条件：1、患者已参加其他临床实验研究；2、同侧已进行过前哨淋巴结活检术；3、不符合逻辑病例：例如手术时间到淋巴结匀浆时间大于45分钟。
　　 本实验全部入组病人67例，排除13例，其中包括良性疾病3例，不符合逻辑病例10例。54例乳腺癌病例临床资料数据如下：
　　 1、手术情况：54例病人保乳根治术36例，改良根治术17例，其他1例。
　　 2、根据肿瘤分期：Stage08例，StageⅠ15例，StageⅡ22例，StageⅢ3例，外院切取活检3例，未知3例。
　　 3、根据肿瘤病理：浸润性导管癌37例，浸润性小叶癌2例，原位癌8例，粘液癌2例，Paget's病Ⅰ例，髓样癌1例，囊内乳头状癌1例，腺样囊状癌1例，实性神经内分泌癌1例。
　　 二、实验方法
　　 1、实验试剂：GeneSearch TM BLN Test Kit，由两部分试剂盒组成，分别为淋巴结准备试剂盒(GeneSearch TM RNA Samp1e Preparation Kit)和乳腺癌淋巴结试剂盒(GeneSearch TM BLN Kit)
　　 2、取材方法：取患者蓝染前哨淋巴结送病理室，将淋巴结按要求切成偶数块，将奇数块送Q-RT-PCR检验，偶数块送病理组织学检验。
　　 3、对CK19及MG进行实时逆转录聚合酶链式反应，使用CepheidSmartCyc1er(R)系统产生目标基因的表达数据。然后根据预先确定的标准，提供定性结果。可快速检测前哨淋巴结大于0.2mm的转移灶。
　　 4、以病理学检验结果为金标准，对比淋巴结Q-RT-PCR结果，评价CK19及MG作为乳腺癌患者腋窝前哨淋巴结状态快速辅助检测指标的敏感性和特异性，以及阳性预测值和阴性预测值。
　　 三、病理诊断标准：
　　 病理学诊断为金标准。病理学阳性是指前哨淋巴结的病理切片中癌转移灶＞0.2mm
　　 四、统计方法
　　 1、采用以下标准公式计算CK19和MG的敏感性和特异性：敏感性=(真阳性/(真阳性+假阴性))*100％特异性=(真阴性/(真阴性+假阳性))*100％
　　 2、采用以下标准公式计算CK19和MG的阳性预测价值和阴性预测价值：阳性预测价值=真阳性/(真阳性+假阳性)*100％阴性预测价值=真阴旺/(真阴性+假阴性)*100％
　　 3、灵敏性、特异性、阳性预测价值和阴性预测价值的95％胃信区间的估计将根据二项分布进行计算。95％CI p-1.96(p(1-p)/n)-2 p+1.96(p(1-p)/n)-2
　　 结果：
　　 1 CK19及MG作为肿瘤标记物行PCR扩增，与病理金标准比较：敏感度：90.91％95％CI：[0.90,0.92]特异性：94.03％95％CI：[0.93,0.95]阳性预测价值71.43％95％CI[0.69,0.73]阴性预测价值98.44％95％CI：[0.98,0.99]卡方检验：P=0.375＞0.05 PCR及连续病理切片无明显差异
　　 2本中心病理及冰冻病理结果一致。符合率：96％ Kappa=1
　　 结论：
　　 CK19及MG作为肿瘤标汜物行PCR扩增，与病理金标准比较敏感性和特异性分别为90.91％和94.03％，阳性预测值和阴性预测值是71.43％和98.44％。PCR扩增CK19及MG可以成为病理检查的一种快速辅助检测手段，与病理结果相比，假阳性率高。是否可以提高患者的总生存率和降低局部复发率，还需要长期随访资料。

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