督脉电针治疗EB诱导的大鼠脊髓脱髓鞘损伤的实验研究

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多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种常见的中枢神经系统脱髓鞘疾病，其确切的病因和发病机制虽未完全阐明，但有关它的治疗在过去几十年中有了长足的发展与进步。目前绝大多数临床和实验室资料支持该病为T细胞介导的自身免疫性疾病。因此，临床上对于该病的治疗主要采用免疫抑制的方法，而细胞移植治疗及传统中医治疗也成为新的治疗研究方向。本实验旨在从内源性少突胶质细胞修复的角度阐明督脉电针治疗多发性硬化的作用机制，为MS的辅助治疗提供一定的线索。本研究分为两部分：
　　第一章溴化乙啶(EB)显微注射建立脱髓鞘模型
　　目的：探讨显微注射EB能否能建立起符合本实验要求的大鼠脱髓鞘脊髓损伤模型。
　　方法：用注射EB的方法制备原发性脱髓鞘脊髓损伤模型。具体如下：SD大鼠(雄性，160～200g)经麻醉后，在T9脊柱敲开椎板(脊柱后侧最高点为T10椎骨的棘突，往嘴侧方向数一个即是T9)，暴露T9～T10胸髓，应用立体定位仪，在该段脊髓纵向每隔2mm注射3个点，每个注射点注射1μl溴化乙锭(EB，0.3mg/ml；分别在深达0.7mm和0.4mm处各注射0.5μl)。术后腹腔注射D-Hank's补充体液1ml，肌肉注射青霉素0.5ml。在15天和30天分别进行各项指标的测试，包括行为学、电生理、免疫荧光组织化学、髓鞘计数、电镜观察、NT-3和LFB等。
　　结果：注射EB组的大鼠后肢行为学评分在术后明显低于假手术组的；电生理结果显示注射EB组的峰峰值都明显比假手术组小，潜伏期要延长。LFB染色显示EB组的背索处出现了淡蓝色的脱髓鞘区域，与正常白质形成鲜明对比。在使用GFAP及APC进行免疫荧光染色，结果发现在损伤区域APC标记的成熟少突胶质细胞及GFAP标记的星形胶质细胞都基本被消耗殆尽，而在损伤区周围却出现了明显的星形胶质细胞增生。在电镜下可见在脱髓鞘的边缘是正常髓鞘与溃变及裸露髓鞘的过渡区域，并在脱髓鞘的中央区域可见大量的裸露轴突。髓鞘计数结果显示，实验组的脱髓鞘区域基本没有正常轴突，假手术组的正常轴突远远比实验组要多。
　　小结：给予大鼠脊髓局部注射EB后，其脊髓脱髓鞘病变、后肢活动功能下降和脊髓电生理变化与多发性硬化症有相似性。因此，我们认为，本研究已成功制备了EB诱导的大鼠脱髓鞘脊髓损伤模型。
　　第二章督脉电针对脱髓鞘治疗作用及机制的研究
　　目的：探讨督脉电针能否促进溴化乙啶(EB)诱导的大鼠脊髓背索脱髓鞘区域的内源性少突胶质细胞增殖、分化和重建髓鞘，促进脊髓功能的恢复，并探讨其中的可能机制。
　　方法：应用SD成年雄鼠69只，在大鼠胸T10脊髓段的背索显微注射EB制备脱髓鞘模型，动物随机分为5组：假手术组、15天EB组、15天督脉电针组，30天单纯EB组，30天督脉电针组。其中督脉电针组在显微注射EB后，第2天开始进行电针治疗，隔天1次，一直持续1个月，并从术后3天开始每隔1天进行独木桥评分。用ELISA试剂盒检测15天组脊髓组织内的神经营养素-3(NT-3)的表达。术后15天及30天进行脊髓诱发电位的检查，分别取出脊髓进行冰冻组织切片，进行NG2和APC的免疫组化染色。30天组的脊髓还进行光镜半薄切片与电镜超薄切片的观察。
　　结果：行为学观察表明，在术后第23天开始，督脉电针组的评分明显低于EB组，说明功能恢复比较好。ELISA检测结果表明，15天督脉电针组脱髓鞘段的NT-3水平明显高于15天EB组。在15天时，少突胶质前体细胞NG2阳性细胞的计数结果表明，督脉电针组的数量明显高于EB组。但APC阳性细胞计数显示两者并没有差异。NG2与NF双标显示，OPCs伸出突起与裸露的轴突发生接触。在30天时间点观察的结果如下：督脉电针组中脊髓诱发电位的峰峰值比单纯EB组的高，且潜伏期已经接近假手术组，而EB组与假手术组仍然存在统计学差异。NG2阳性细胞的计数结果显示，两个实验组间没有统计学差异。但是APC阳性细胞的计数显示，督脉电针组的APC阳性细胞明显多于EB组。髓鞘计数结果也显示，督脉电针组的新生髓鞘明显多于EB组。在电镜下可见，正常溃变及新生3种形态的髓鞘，还观察到成熟的少突胶质细胞包绕轴突形成新生的髓鞘，而且还有雪旺细胞迁移进去参与髓鞘的形成。APC与NF的双标显示，成熟的少突胶质细胞已经断断续续的包绕裸露的轴突。
　　小结：督脉电针可以提高脊髓脱髓鞘区域的NT-3水平，能够促进脊髓内源性少突胶质前体细胞的增殖、分化和重新髓鞘化，从而促进功能的恢复。

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作者
黄斯凡;
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作者单位

中山大学;

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授予单位中山大学;
学科人体解剖与组织胚胎学
授予学位硕士
导师姓名曾园山;
年度 2010
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R744.51;R245.97;
关键词
督脉电针; 多发性硬化; 脊髓脱髓鞘损伤; 少突胶质细胞; 重建髓鞘; 动物实验;

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