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激活巨噬细胞诱导鼠角膜新生血管形成的实验研究

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摘要

新生血管形成常见于炎症、肿瘤、缺血和创伤愈合等病理过程，在眼部常见于角膜化学伤、新生血管性青光眼、视网膜新生血管性疾病等。新生血管能提供组织细胞生长修复所需的营养物质及氧，同时排出机体的代谢产物，促进创伤愈合。但是在一些病理情况下，新生血管的生长对机体是不利的。新生血管增殖可促进肿瘤的生长和转移，加剧类风湿性关节炎中软骨的破坏及其病情进展，增强动脉粥样硬化斑块的不稳定性。新生血管所致的眼部疾病是致盲的主要原因。新生血管是糖尿病性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性等视网膜新生血管性疾病致盲的关键因素。新生血管性青光眼可致顽固性眼压增高，进而造成永久性视神经损伤。同时大量新生血管可使角膜失去透明性，导致失明，新生血管也是角膜移植排斥反应发生的高危因素。 新生血管的发生机理及防治一直是血管领域研究的热点，但是新生血管形成的确切机制尚未完全清楚。目前，对新生血管形成机制的研究中，低氧诱导学说、炎症学说和细胞因子不平衡学说是大多数学者接受和认可的。巨噬细胞是重要的血管源性效应细胞，其激活状态可产生大量的生长刺激因子、蛋白水解酶和调节新生血管形成的细胞因子，在炎症、创伤愈合和肿瘤新生血管形成中起关键作用。近年来巨噬细胞在新生血管形成中的作用越来越受到重视。然而，炎症和肿瘤的新生血管形成是一个多种细胞及因子参与的复杂的病理过程，在这个复杂的病理生理过程中，由于多种因素的参与，不利于明确巨噬细胞在新生血管形成中的作用及其机制。因此，本实验将激活的巨噬细胞植入角膜囊袋内，在较少的干扰因素下，观察激活的巨噬细胞是否能诱导新生血管形成，进而探讨其相关的调节机制。类似研究国内外文献尚未见报道。 目的： 观察激活巨噬细胞可否诱导新生血管形成，探讨其中可能的作用机制，为新生血管性疾病的治疗研究提供新的参考途径。 方法： 1.细胞的获得、分离、培养、鉴定、相关因子表达检测及DiI标记 1.1激活巨噬细胞的获得、分离和培养 SD大鼠腹腔注射石蜡油1ml，4天后，无菌条件下收集腹腔灌洗液中的细胞。1640完全培养基培养收集到的细胞，观察细胞形态及其生长状态。 1.2激活巨噬细胞的鉴定 1.2.1免疫荧光检测巨噬细胞相关抗原 收集到的大鼠腹腔细胞行CD68、CD163免疫荧光染色，检测巨噬细胞的特异抗原表达。同时行PDGF和TGF—β染色，对巨噬细胞激活状态进行鉴定，行MMP—9、VEGF促血管形成因子的表达检测。 1.2.2流式细胞仪检测巨噬细胞吞噬功能 FITC—dextran吞噬实验鉴定巨噬细胞的吞噬功能及巨噬细胞在腹腔收集液细胞中所占的比例。 1.2.3逆转录－聚合酶链式反应（RT—PCR）检测激活巨噬细胞相关因子的表达 对巨噬细胞PDGF和TGF—β的mRNA表达水平检测，鉴定其是否处于激活状态。对其表达的MMP—9和VEGF的mRNA水平进行检测。 1.2.3 DiI标记及其标记阳性率的流式细胞仪检测 将收集到的巨噬细胞行荧光染料DiI标记，并行流式细胞仪检测被标记的细胞含量。 1.3固定后巨噬细胞的获得及鉴定 4％多聚甲醛固定腹腔收集的激活巨噬细胞，MTT法测定固定后巨噬细胞的活性。 1.4角膜中央上皮细胞的获得、分离和鉴定 取成年SD大鼠双眼角膜中央上皮组织，胰酶消化法将取得的角膜中央上皮消化至单个细胞悬液。 免疫荧光染色鉴定角膜上皮细胞CK的抗原表达，同时行MMP—9及VEGF血管形成因子检测。 流式细胞仪检测DiI荧光染料标记阳性的细胞比例。 2.实验动物分组及角膜囊袋新生血管模型的建立 将实验动物随机分为激活巨噬细胞组（A—Mψ（Activated Macrophages）组，23只），空白对照组（PBS组，23只），4％多聚甲醛固定后巨噬细胞组（F—Mψ（Fixed Macrophages）组，23只），中央角膜上皮细胞组（CEC（comeal epithelial cells）组，23只），其中PBS组、F—Mψ组及CEC组均为对照组。在大鼠角膜中央做一长约1.3～1.5mm长的手术切口，向颞侧分离角膜基质，做一囊袋，囊袋顶端据角膜缘约1～1.2mm，将细胞植入制备好的囊袋内。A—Mψ组、F—Mψ组及CEC组，分别在角膜囊袋内植入DiI标记的激活的巨噬细胞、4％多聚甲醛固定后的巨噬细胞和角膜中央上皮细胞，细胞密度1×107个/ml，微量注射器注射1μl剂量。PBS组在角膜囊袋内注入1μl的无菌PBS。 3.裂隙灯及荧光显微镜观察 术后每天裂隙灯显微镜下观察各组手术眼角膜情况并照相，至术后14天。其中术后第1天，各组随机取2只动物的实验眼眼球，荧光显微镜下观察注入的DiI荧光染料标记的细胞。动物观察至术后第14天，裂隙灯下观察并照相，荧光显微镜观察角膜组织中注入的细胞。 4.墨汁心脏灌注 术后第5天，各组随机取7只动物行墨汁心脏灌注角膜新生血管显影，留取角膜组织，裂隙灯下照相。 5.CNV长度和面积的统计分析 Image Pro—Plus5.1图像处理软件行CNV长度及面积测量，SPSS16.0软件包对四组测量数据进行统计分析。 6.RT—PCR检测角膜组织相关血管形成因子的mRNA表达 术后第5天，取A—M（）和PBS组角膜检测PDGF、TGF—β、MMP—9、VEGF的mRNA表达。 术后第5天，4组角膜组织MMP—9、VEGF的mRNA水平检测。 7.免疫荧光染色检测各组角膜组织MMP—9及VEGF的表达 检测术后第5天，各组角膜组织中MMP—9及VEGF的表达。 结论： 1.角膜囊袋内植入激活的巨噬细胞能成功诱导大鼠角膜新生血管形成。 2.激活的巨噬细胞诱导大鼠角膜新生血管形成的机制，与其自身表达并上调角膜组织中MMP—9及VEGF的表达有关。

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