Mdx小鼠骨骼肌中炎症反应和mpeg1的表达

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目的:进行性肌营养不良(progressive muscular dystrophy，PMD)是一组以进行性加重的肌无力、肌萎缩为主要临床表现的遗传性骨骼肌疾病的总称。由于患者编码肌细胞相关蛋白的基因变异，造成蛋白缺陷或功能障碍，导致肌细胞的完整性遭到破坏，其中Duchenne肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)在各类肌营养不良中发病率最高，约为1/3500男婴，且无地域和种族间明显差异。DMD是一种X连锁隐性遗传性疾病，其致病基因位于X染色体的Xp21区，为编码dystrophin蛋白的基因发生缺失、插入和点突变，dystrophin蛋白的功能缺失引起肌纤维的变性和坏死。女性多为致病基因携带者，发病者罕见，且症状较轻。DMD发病年龄偏小，起病隐袭，且病死率高，受到广泛关注。
　　目前关于DMD的发病机制尚不清楚，涉及到很多常见的机制，例如钙离子内流，炎症细胞浸润，促炎和促进纤维化细胞因子的激活，各种蛋白水解酶的活化，自噬的缺陷和细胞凋亡等。研究显示局部的炎症反应是肌肉纤维化和脂肪组织渗透的触发点，最终导致肌细胞纤维化并由脂肪组织替代，失去功能。在炎症反应中，巨噬细胞浸润起着关键作用，如激活的巨噬细胞能产生NO来裂解肌细胞，同时作为主要的促炎因子，通过激活蛋白水解酶系统和抑制肌肉再生引起肌肉萎缩等。
　　巨噬细胞表达基因1(Macrophage expressed gene1，mpeg1)是首个被发现高表达于人类和鼠科动物巨噬细胞内的基因。先前的实验显示在斑马鱼中转入mpeg1基因后巨噬细胞系反应明显增加，这就使得嗜中性粒细胞与巨噬细胞得以分别被研究，说明mpeg1特异性表达于巨噬细胞内。
　　C57BL/10ScSnDmd mdx/JNju小鼠(X-linked muscular dystrophymouse，X-连锁肌萎缩小鼠，简称mdx小鼠)为编码dystrophin蛋白的3185位基因自发突变，使该位点编码谷氨酰胺的密码子变成了终止密码子，导致基因的表达提前终止，造成其编码的蛋白缩短。该模型鼠与DMD患者有相同的遗传基础，已经被广泛用于DMD研究的各个领域。
　　本实验欲通过组织化学染色方法观察mdx小鼠不同骨骼肌的病理改变，利用基因芯片技术筛选与炎症相关基因在疾病不同时期的动态表达，进一步通过实时定量PCR(qRT-PCR)技术观察mpeg1在mdx小鼠及对照鼠中的表达。探讨巨噬细胞相关性炎症在mdx小鼠中的作用，进而通过抑制巨噬细胞相关性炎症反应来改善肌肉质量，为DMD提供新的治疗靶点。
　　方法:选取雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠（购于南京大学模式动物研究所）为实验组，对照组为雄性C57BL/6ScSn小鼠，根据年龄分为2w、4w、8w、12w。每组各时间点选取6只，3只用于常规组织化学染色，3只用于基因芯片检测和qRT-PCR测定。以10％水合氯醛(350mg/Kg体重)腹腔注射麻醉，取小鼠股四头肌、腓肠肌、胫骨前肌、肱二头肌、心肌，进行包埋冰冻处理。设置切片厚度为8um，做连续切片。分别对冰冻切片行常规染色，包括HE染色、MGT染色、ACP染色观察其光镜下的形态学变化，总结mdx小鼠骨骼肌炎性病理变化;小鼠麻醉后，取小鼠股四头肌迅速投入液氮冷冻，之后保存于-80℃冰箱，用于mRNA提取，基因芯片的检测及mpeg1的qRT-PCR检测，结果应用spss13.0对数据进行分析。
　　结果:
　　1、利用常规组织化学方法，我们观察到2w的mdx小鼠股四头肌、腓肠肌、胫骨前肌和肱二头肌中肌细胞大小基本一致，偶见高度浓染的肌纤维，未见肌细胞坏死，炎症细胞浸润;4w可见巨噬细胞吞噬现象散在分布，偶见小灶样分布;8w时炎细胞浸润灶融合成片，12w时炎性病灶面积减小;mdx小鼠心肌中未见到变性、坏死和炎细胞浸润;同龄对照鼠各骨骼肌中未见上述病理改变;
　　2、利用基因芯片技术对mdx小鼠股四头肌进行mRNA测定，筛选出有关炎症反应的基因30余个，结果显示与2w相比，炎症反应相关基因随疾病进展表达量增加，在8w时达到峰值，12w有所下降，但较2w时仍有升高，差别具有统计学意义（P＜0.05）;
　　3、利用qRT-PCR技术对mpeg1基因进行定量分析，结果显示在2w时，mdx小鼠与对照鼠之间mpeg1的含量无差别;从4w开始，mdx小鼠中mpeg1的含量逐渐增加，8w时含量最高，与对照鼠同周龄间差别有统计学意义(P＜0.05)，但mdx小鼠4w、8w、12w之间表达量差别无统计学意义;而对照鼠各周龄间差别无统计学意义;
　　结论:
　　1、炎症反应参与mdx小鼠疾病的发生发展:从2周开始出现，8周达到高峰，12周趋于平稳;
　　2、Mpeg1在mdx小鼠炎症反应中发挥了一定的作用。

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作者
要萌萌;
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作者单位

河北医科大学;

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授予单位河北医科大学;
学科神经病学
授予学位硕士
导师姓名宋学琴;
年度 2015
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肌营养不良症;
关键词
Duchenne肌营养不良; 炎症反应; 病理特点; 基因芯片; 巨噬细胞表达基因1;

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