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真核起始因子eIF3e与亨廷顿蛋白相关蛋白1相互作用并调控神经元突起发育

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前言

材料与方法

1. 实验动物

2. 细胞

3. 质粒菌株

4. 抗体

5. 其他主要试剂

6. 实验液体配制

7. 细胞系培养

8. 原代大脑皮质神经元分离培养

9. 细胞系转染

10. 原代大脑皮质神经元转染

11. 荧光共振能量转移

12. 免疫共沉淀

13. 免疫荧光双标染色

14. 蛋白质免疫印迹

15. 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）

16. 数据统计学分析

结果

1. eIF3e与HAP1具有相互作用

2. 过表达eIF3e抑制神经细胞突起生长

3. 过表达eIF3e降低HAP1水平

4.过表达HAP1减弱eIF3e对神经突起生长的抑制作用

讨论

参考文献

综述:真核翻译起始因子eIF3e研究进展

致谢

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摘要

真核起始因子（eIFs）是指参与真核翻译起始过程的蛋白质，其种类多且复杂，目前已鉴定的真核起始因子共有12种（eIF1-12）。真核起始因子通过相互之间以及不同的真核起始因子与核糖体、mRNA或起始tRNA之间的相互作用，来完成真核生物的翻译起始。eIF3是哺乳动物中分子量最大和最复杂的真核起始因子，由eIF3a-eIF3m13种亚基组成。eIF3不仅在蛋白质翻译起始调控中发挥重要作用，多种 eIF3亚基，如 eIF3ba，eIF3ha，eIF3m，还与胚胎发生和神经发育调节有关。eIF3e是 eIF3复合物的第5个亚基，作为“鼠乳腺瘤病毒结合位点6”又被称为INT6。eIF3e在进化中被保留下来，存在于大多数真核生物中，并在人类细胞中广泛表达。eIF3e在翻译过程中加强eIF3复合体的稳定性，提高组蛋白翻译水平，参与 mRNA的降解及蛋白降解过程。在胚胎鼠中，eIF3e在发育中的迁移神经嵴细胞中表达，提示其也与神经发育调节有关。
　　亨廷顿蛋白相关蛋白1（HAP1）是最早被发现能与亨廷顿病基因产物亨廷顿蛋白（huntingtin）结合的蛋白，在中枢和周围神经系统中广泛表达。HAP1作为连接微管马达蛋白与被转运物的衔接蛋白，参与胞内运输，同时HAP1还影响很多神经系统疾病的发生发展，在大脑发育及突起可塑性中发挥重要作用。本实验室前期实验曾观察到，eIF3e在小鼠胰岛β细胞瘤细胞INS-1细胞中可与HAP1结合。提示在发育中的迁移神经嵴细胞中表达的eIF3e可能通过与HAP1相互作用参与神经细胞的发育。
　　为探讨eIF3e与神经发育的关系，本研究在明确eIF3e与HAP1相互作用的基础上，检测eIF3e在神经元突起生长中的作用。
　　1. eIF3e与HAP1具有相互作用 HAP1根据其C末端氨基酸序列的不同，可至少分为HAP1A和HAP1B两种同工异构体（isoform），其中HAP1A大量以点状或颗粒状的stigmoid小体（stigmoid body）形式存在于神经元胞体和突起内，而HAP1B则主要以弥散形式分布在胞质中。为了进一步明确eIF3e是否与HAP1相互作用，首先观察了 eIF3e是否在 HAP1A的 stigmoid小体上共定位。将HEK293T细胞共转染表达HAP1A-YFP和eIF3e-CFP后，激光扫描共聚焦显微镜观察发现，大量 eIF3e-CFP定位在 HAP1A-YFP的 stigmoid小体上。在HEK293T细胞共转染表达eIF3e-Myc和HAP1A–GFP，通过免疫沉淀分析显示，过表达的eIF3e与HAP1A有强结合能力。荧光共振能量转移（FRET）实验分析显示，在共转染表达HAP1A-YFP和eIF3e-CFP的HEK293T细胞中，eIF3e-CFP与HAP1A-YFP之间具有明显的能量共振转移。在大鼠大脑原代皮质神经元中共转染表达HAP1A-YFP和eIF3e-CFP后，激光扫描共聚焦显微镜观察也发现大量eIF3e-CFP定位在 HAP1A-YFP的 stigmoid小体上。对大鼠下丘脑切片内源性HAP1和eIF3e进行免疫荧光双标染色观察,可见大量eIF3e定位在HAP1标记的stigmoid小体上。进一步的免疫共沉淀分析显示，小鼠成神经瘤细胞（N2a细胞）及小鼠下丘脑内的eIF3e与HAP1具有明显的相互作用。
　　2.过表达 eIF3e抑制神经细胞突起生长突起生长是神经元分化发育的标志之一。为了为证明eIF3e与神经发育的关系提供线索，首先观察了过表达eIF3e-CFP对N2a细胞突起生长的影响。在N2a细胞中转染表达eIF3e-CFP、以无血清培养诱导分化后，对细胞突起长度测定显示，过表达eIF3e-CFP的N2a细胞的突起长度明显短于转染表达对照质粒的N2a细胞；表明eIF3e对诱导分化的N2a细胞的突起生长具有明显的抑制作用。在大鼠大脑原代皮质神经元中转染表达eIF3e后，神经元突起的长度明显短于转染表达对照质粒的神经元。由此表明， eIF3e对神经元突起生长具有明显的抑制作用。
　　3.过表达 eIF3e降低 HAP1水平 HAP1对神经元的突起生长具有促进作用。为探讨对蛋白质翻译、降解及 mRNA降解具有调控作用的 eIF3e是否通过影响HAP1水平而抑制神经元突起生长发育，将N2a细胞过表达eIF3e后，应用Western blot对细胞内HAP1水平进行检测。结果显示，过表达eIF3e的N2a细胞中，HAP1水平显著降低。进一步的RT-PCR检测显示，过表达eIF3e的N2a细胞中HAP1 mRNA水平无明显变化。因此，过表达eIF3e对HAP1水平的下调可能由于影响HAP1 mRNA的翻译过程或HAP1的降解所致。
　　4.过表达HAP1减弱eIF3e对神经突起生长的抑制作用为了进一步明确eIF3e通过下调HAP1水平抑制神经元突起的生长，继而检测了过表达HAP1对过表达eIF3e抑制神经元突起生长作用的影响。结果显示，共转染表达eIF3e-CFP和 HAP1A-YFP的 N2a细胞和大鼠大脑原代皮质神经元的突起明显长于单转染表达eIF3e-CFP的N2a细胞和大鼠大脑原代皮质神经元。由此表明，HAP1能降低eIF3e对神经元突起生长的抑制作用，eIF3e可通过下调HAP1水平抑制神经细胞突起生长。
　　结论：本研究表明，eIF3e能与HAP1相互作用，通过这种相互作用下调HAP1蛋白水平，进而抑制神经元突起的生长发育。

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