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小鼠附睾小体mRNAs的特点及翻译后介导精子成熟新机制的体外研究

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第一部分 小鼠不同亚群附睾小体的分离及特点

前言

材料与方法

实验结果

讨论

实验小结

参考文献

第二部分 小鼠附睾小体mRNAs的表达特点及其可翻译性

前言

材料与方法

实验结果

讨论

实验小结

参考文献

第三部分小鼠附睾小体向HEK 293T细胞递入mRNAs及翻译蛋白

前言

材料与方法

实验结果

讨论

实验小结

参考文献

第四部分 小鼠附睾小体向精子递入mRNAs及翻译蛋白

前言

材料与方法

实验结果

讨论

实验小结

参考文献

结论

创新点

综述: 精浆游离核酸的研究进展

致谢

附录一（攻读学位期间发表论文情况）

附录二（英文缩略词一览表）

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摘要

第一部分：小鼠不同亚群附睾小体的分离及特点
　　目的：分析不同亚群附睾小体--微囊泡（microvesicles, MVs）和外泌体（exosomes, EXs）的含量、形态、大小及表面分子标志物是否有差异，为研究附睾小体及其内含物的功能提供依据。
　　方法：取8-10周龄雄性Balb/c小鼠30只，处死后分离附睾，用眼科剪将附睾剪碎使附睾液流出；离心去除附睾液中的精子、细胞、凋亡小体及细胞碎片，上清16,500 g离心20 min收集MVs沉淀，上清120,000 g离心70 min，沉淀用PBS重悬后再次120,000 g离心70 min，去除蛋白杂质，得到的沉淀即为EXs；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）法测定MVs、EXs的浓度；透射电镜（transmission electron microscope, TEM）下观察MVs、EXs的形态；纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking anailsis, NTA）检测其颗粒大小的分布范围；Western Blot检测表面分子标志物CD9、CD63、ICAM1的表达。
　　结果：分离所得MVs、EXs的含量相近，平均每只小鼠中分别含有84μg、89μg；透射电镜下可见MVs、EXs均为圆形或椭圆形的膜结构；NTA结果显示MVs、EXs颗粒直径的均值分别为187±94 nm、169±94 nm，众数分别为127 nm、132 nm；MVs、EXs均表达CD9、CD63、ICAM1这三种表面分子标志物。
　　结论：小鼠附睾小体的两种亚群--MVs和EX在附睾液中的含量相近，二者形态相似，颗粒大小无明显差异，且表达相同的表面分子标志物CD9、CD63、ICAM1。
　　第二部分：小鼠附睾小体mRNAs的表达特点及其可翻译性
　　目的：分析 mRNAs在不同亚群附睾小体中的分布及附睾头部、体尾部来源的附睾小体mRNA的表达谱，并初步探索附睾小体mRNAs的可翻译性。
　　方法：RT-qPCR分析不同亚群附睾小体（MVs、EXs）中附睾特异性基因Spag11a、Eppin、Defb22、Wfdc2、Crisp1、Wfdc9、Adam7的表达量；基因表达谱芯片技术比较附睾头部、体尾部来源的附睾小体mRNAs的差异；RT-PCR扩增附睾小体中Spag11a、Eppin、Defb22等附睾特异性基因的编码区（coding sequence, CDS）及mRNA全长；然后将附睾小体RNA（200μg/ml）加入兔网织红细胞裂解液翻译系统中，阴性对照组加入nuclease-free water，双向电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electro- phoresis,2D-PAGE）比较上述两组体外翻译产物蛋白谱的差异。
　　结果：大部分附睾特异性 mRNAs在 MVs中的含量相对较高，约为 EXs的2.1-14.1倍，但这些mRNAs在EXs中仍有明显的表达，且有少部分mRNAs（Spag11a，Wfdc9）在EXs中比在MVs中含量高；结合内参分析这些mRNAs在附睾小体中的相对丰度表明：有些mRNAs在MVs中相对丰度较高，而有些mRNAs在EXs中相对丰度较高，且结果会因选择的内参的不同而改变；mRNA表达谱分析表明头部来源的和体尾部来源的附睾小体相比较，头部来源的附睾小体上调4倍以上的有2188个，GO富集分析显示这些基因主要调节 mRNA的剪接、组蛋白甲基化、染色质组装等生物学过程；体尾部来源的附睾小体上调4倍以上的有1506个，GO富集分析显示这些基因参与了精子成熟、分化、运动等生物学过程；附睾小体中含有 Spag11a、Eppin、Defb22等基因的全长mRNA；附睾小体RNA的体外翻译产物与阴性对照组相比，有132个上调的蛋白点，8个新出现的蛋白点。
　　结论：不同种类mRNAs在小鼠附睾MVs、EXs中的表达量无一致的规律，无明显富集于某种亚群的趋势；附睾头部、体尾部来源的附睾小体 mRNAs有其特定的表达特点，所富集的差异 mRNAs的基因所参与不同生物学功能可能与附睾不同区域的功能相关；附睾小体含有全长mRNA，具有被翻译成蛋白的潜能。
　　第三部分：小鼠附睾小体向HEK293T细胞递入mRNAs及翻译蛋白
　　目的：研究小鼠附睾小体被HEK293T细胞摄取、递入mRNAs及翻译蛋白的情况，为探讨附睾小体mRNAs的可能功能提供依据。
　　方法：将HEK293T细胞分别与PKH26、SYTO RNASelect标记的附睾小体（50μg/106 cells）共孵育1 h，荧光显微镜下观察细胞对附睾小体的摄取及递入mRNAs的情况；将HEK293T细胞与未标记的附睾小体（200μg/106 cells）共孵育，RT-PCR分别检测共孵育1、2、4、8、12、24 h后细胞中Spag11a、Eppin、Defb22等附睾特异性mRNAs；2D-PAGE分析附睾小体、共孵育细胞及未处理细胞的蛋白表达谱，并采用质谱分析鉴定共孵育细胞中新增加的蛋白点；利用放线菌酮（cycloheximide, CHX）对真核细胞翻译的抑制作用分析共孵育细胞中新增蛋白是来源于附睾小体蛋白的直接递入还是附睾小体 mRNAs的翻译，或是两种机制共同参与，设置以下分组：共孵育组（HEK293T细胞+附睾小体），抑制剂组（HEK293T细胞+附睾小体+CHX），未处理组（HEK293T细胞），其中附睾小体浓度为200μg/106 cells，CHX的终浓度为20μg/ml；培养24 h后Western Blot检测附睾小体及三组细胞中所筛选蛋白表达量。
　　结果：HEK293T细胞与附睾小体共孵育1 h后，荧光显微镜下见附睾小体被细胞摄取并递入 mRNAs；不同时间点的共孵育细胞中均检测到 Spag11a、Eppin、Defb22等附睾特异性mRNAs；2D-PAGE结果显示与未处理组相比，共孵育组细胞中表达上调的蛋白点有96个，其中新出现的蛋白点有40个，有4个蛋白点在附睾小体中无表达；质谱鉴定出NPM、PDIA3、SETD7等10种蛋白，其中NPM是附睾小体内不含的蛋白；Western Blot结果与2D-PAGE一致，附睾小体中无NPM蛋白的表达，但有PDIA3、SETD7等蛋白的表达，未处理组HEK293T细胞中无NPM、PDIA3、SETD7等蛋白的表达，共孵育组细胞中上述蛋白的表达量均明显高于抑制剂组（p<0.01）。
　　结论：附睾小体可被HEK293T细胞摄取并递入mRNAs，这些mRNAs可在受体细胞中翻译出新的蛋白。共孵育组细胞中 NPM蛋白的表达全部来源于附睾小体中Npm mRNA的翻译，PDIA3、SETD7等蛋白的表达部分来源于相应附睾小体 mRNAs的翻译。因此，附睾小体中的mRNAs可能是细胞间信息传递的新分子种类和新机制。
　　第四部分：小鼠附睾小体向精子递入mRNAs及翻译蛋白
　　目的：研究小鼠精子对附睾小体 mRNAs的摄取及翻译蛋白的情况，探索精子成熟的新机制。
　　方法：研究小鼠附睾尾部精子与附睾小体共孵育后精子蛋白表达量的变化，并利用氯霉素（Chloramphenicol, CP）对精子蛋白合成的抑制作用分析共孵育精子中蛋白的增加是来源于附睾小体蛋白的直接递入还是附睾小体mRNAs的翻译或是两种机制共同参与。取40只8-10周龄的雄性Balb/c小鼠，处死后分离附睾，取附睾尾部精子并用IVF-30调整密度至（2-3）×107/ml，均分为以下三组：共孵育组（精子+附睾小体），抑制剂组（精子+附睾小体+CP），未处理组（精子），其中附睾小体浓度为50μg/107 sperm，CP的终浓度为0.1 mg/ml；培养6 h后Western Blot检测附睾小体及三组精子中NPM、PDIA3等在第三部分实验中筛选的蛋白，及CRISP1、ADAM7、DEFB1等精子功能相关蛋白的表达量。
　　结果：Western Blot结果显示附睾小体中无NPM蛋白的表达，PDIA3、CRISP1、ADAM7、DEFB1等蛋白在附睾小体中的表达量很低；共孵育组细胞中上述蛋白的表达量明显高于未处理组和抑制剂组（p<0.01），而抑制剂组和未处理组蛋白的表达量基本相同（p>0.05）。
　　结论：附睾小体可向精子递入 mRNAs并被用于蛋白翻译。共孵育后精子中NPM蛋白表达量的增加完全来源于附睾小体中Npm mRNA的翻译，PDIA3、CRISP1、ADAM7、DEFB1等蛋白表达量的增加部分来源于相应附睾小体mRNAs的蛋白翻译。因此，附睾小体mRNAs可能参与了精子蛋白合成及成熟的过程。

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