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表达融合蛋白CFP21-MPT64和ESAT-6-CFP10的DNA疫苗增强BCG初免小鼠抗结核病的保护性

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综述 初免-增强免疫策略抗结核病的研究进展

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摘要

背景及目的：
　　 BCG 作为预防TB的唯一疫苗在全球广泛使用。发展中国家每年有超过90％的儿童接种BCG 疫苗。但BCG 对成人TB的保护效力却存在很大波动，其机制尚不明确。
　　 目前，M.tb H37Rv基因组中共鉴定了16个BCG 缺失区域即RD 区。其中RD1 区仅存在于致病性分枝杆菌中，在世界各地的BCG 菌株中均缺失，被认为是BCG 最初减毒的主要决定因素；RD2 区缺失，可以进一步把世界范围内分布的不同BCG 亚株分为早期株和晚期株。目前已经明确RD1 区丢失的同时对BCG的保护效果也产生了影响。那么，RD2 区的缺失会给BCG的保护效力带来什么样的影响呢？是否会是造成BCG 对成人TB 保护性不稳定的原因呢？针对这些问题，我们分别建立了RD1 区所编码的融合抗原ESAT-6-CFP10(rEC)和RD2区所编码的融合抗原CFP21-MPT64(rCM)的原核表达系统和真核表达质粒（我们的前期工作已研究rCM 原核表达系统的构建和免疫原性）。首先比较了两种融合抗原在人群中的免疫原性；其次，在C57BL/6 小鼠模型中比较研究这两种重组真核质粒作为DNA疫苗，在BCG 初免联合DNA疫苗增强策略中的免疫保护性；最后，进一步探讨RD2 区缺失对BCG 保护效力带来的影响和初免增强策略的优越性。
　　 方法：
　　 1.利用PCR法分别扩增获得esat-6和cfp10的基因；用GeneSOEing 技术构建新的融合基因esat-6-cfp10，并将其分别克隆入原核表达载体pProEXHTb和真核表达载体pcDNA3.1(-)中，得到重组原核表达质粒pPro610和重组真核质粒pcD610。将表达融合蛋白rCM的重组原核质粒pPro2164 酶切，亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)中，得到重组真核质粒pcD2164。
　　 2.分别将pPro610和pPro2164 转化入E.coli BL21 菌株，经IPTG 诱导表达，Ni-NTA 纯化，尿素梯度透析复性获取rEC和rCM 蛋白。rEC 蛋白的表达和纯化的过程，分别用SDS-PAGE 验证，并用anti-ESAT-6和anti-CFP10 Ab 经Western blotting验证。纯化rEC和rCM 蛋白的纯度进一步用SDS-PAGE 证实，并经BCA 法定量。
　　 3.分别将pcD610和pcD2164 转化的E.coli DH5α扩增，用Qiagen Plasmid Giga kit提取纯化，并经紫外吸收法定量。
　　 4.对活动性肺结核的密切接触者进行WBIA（the whole blood IFN-γ assay）试验，比较两种融合抗原rEC和rCM在人群中的免疫原性。
　　 5.采取BCG（中国株）初免-pcD610或pcD2164 增强的方式，免疫C57BL/6 小鼠，通过ELISA 法检测外周血特异性抗体和体外抗原诱导脾淋巴细胞产生的IFN-γ、qRT-PCR法检测肺脏组织细胞因子和iNOS mRNA表达水平等手段，分析比较不同免疫策略中疫苗在小鼠模型中的免疫原性。
　　 6.对免疫后的小鼠进行M.tb H37Rv 毒株攻击实验，通过组织荷菌量、组织病理学改变等指标评价不同免疫策略中疫苗的保护性。
　　 结果：
　　 1.基因测序和酶切证实重组原核质粒及重组真核质粒构建成功。
　　 2.SDS-PAGE和Western blotting 试验证实融合抗原rEC的原核表达和纯化成功；
　　 纯化的rEC和rCM 经SDS-PAGE 证实。
　　 3.rEC-WBIA 刺激TST+健康人群产生了比TST-健康人群更高的IFN-γ（p<0.05）；rCM-WBIA 刺激TST+健康人群产生了比TST-健康人群更高的IFN-γ（p<0.05）;
　　 rCM-WBIA中TST+健康人群和TST-健康人群产生的IFN-γ水平，均高于rEC-WBIA中的结果，但差异均不具有统计学意义（p>0.05）。
　　 4.小鼠外周血抗原特异性IgG 抗体分析结果表明针对融合蛋白rEC的特异性抗体反应，pcD610 免疫组和 BCG 初免pcD610 增强免疫组明显高于其它组；针对融合蛋白rCM的特异性抗体反应，pcD2164 免疫组和 BCG 初免联合pcD2164 增强免疫组最高。
　　 5.抗原特异的小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ检测结果为：重组质粒免疫组和BCG与重组质粒联合免疫组的IFN-γ水平明显高于BCG组，且BCG 初免联合pcD2164 增强免疫组最高。
　　 6.免疫小鼠肺脏组织中，与免疫保护有关的细胞因子IFN-γ、TNF-α和可抑制细菌生长的iNOS mRNA表达，BCG 初免DNA增强免疫组都表现出强于或与BCG组相当的水平；相对地，在抑制保护性免疫、利于细菌生长的调节性细胞因子TGF-β和IL-10 mRNA表达中，BCG 初免DNA增强免疫组则处于较低的水平。
　　 7.M.tb H37Rv 攻击4周后，小鼠组织荷菌量数据表明，疫苗免疫组都有不同程度的下降，其中BCG 初免联合DNA增强免疫组比仅接种BCG或DNA疫苗组更低，最低荷菌量出现在BCG 初免联合pcD2164 增强免疫组中。
　　 8.肺脏组织病理学检查结果与荷菌量一致，采用BCG 初免联合DNA增强免疫方案组的病理改变评分明显低于仅接种BCG或DNA疫苗组，且BCG 初免联合pcD2164 增强免疫组最低。
　　 结论：
　　 我们的研究表明pcD610和pcD2164是两种在初免-增强策略中有着良好应用前景的候选DNA疫苗，且支持RD2 区缺失会对BCG 保护效力产生重要影响的观点。这一发现不但有助于筛选保护性最优的BCG 株用于新生儿接种，而且有助于构建合理有效的抗TB 新疫苗。

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