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JNK-IN-8作为JNK信号通路不可逆抑制剂在治疗骨吸收相关疾病的机制和作用

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前言

第一部分 JNK-IN-8对破骨细胞的影响

1 材料及方法

2 结果

第二部分 JNK-IN-8对于RANKL诱导的破骨细胞的作用机制

1 材料及方法

2．结果

第三部分 JNK-IN-8对于去卵巢处理后c57小鼠的骨质丧失模型的影响

1 材料及方法

2．结果

讨论

全文总结

参考文献

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摘要

研究目的:骨破坏相关活动可导致骨骼疾病的发生，这类疾病是一种退化性疾病，此类疾病的特征是破骨细胞的数量增加以及活动的增强，进而导致软骨的下方骨质的破坏丧失和软骨的逐渐退化。通过将破骨细胞的分化增殖抑制，可以阻滞软骨的下方骨的丧失，JNK信号通路通过调节破骨细胞的增殖以及功能来影响骨丧失类疾病的发生。JNK-IN-8作为被发现的第一种不可逆的JNK信号通路抑制剂，在本次研究中我们进行一系列体内及体外试验来评估其对破骨细胞的形成过程中增殖和分化的影响，以及对骨的保护以和对于骨关节炎的潜在的治疗作用。
　　研究方法:在体外实验中1.通过CCK-8法对不同浓度(0，0.125，0.25，0.5，1，2μM)JNK-IN-8干预不同时间(48h)的骨髓间充质干细胞进行生存分析，寻找合理的药物浓度;2.在体外利用RANKL诱导髓间充质干细胞及RAW264.7细胞形成破骨细胞体系，通过TRAP染色进行计数以及统计学评价JNK-IN-8对OCs形成和生存的影响。3.应用Real-Time PCR技术检测JNK-IN-8对于RANKL诱导的BMMs细胞相关基因TRACP、CTR、NFACT、TAP、ACP5、CTSK的影响;4.应用Western blot方法验证JNK-IN-8对于MAPK信号通路下游JNK信号通路下游的磷酸化的影响。在体内实验中:1.建立c57小鼠的去卵巢骨质疏松模型;2.将建模验证成功后的c57小鼠分为4组，分别是OVX对照组、JNK-IN-8刺激低剂量组、JNK-IN-8刺激高剂量组、唑来膦酸盐刺激的sham组，进行相应处理。3两月后取胫骨进行Micro-CT扫描分析，应用Real-Time PCR技术检测胫骨。
　　研究结果:1.细通过胞生存分析我们发现药物浓度为2μM JNK-IN-8干预48h后抑制率约50％，(F=9.95，P＜0.01)，本次试验中其他浓度的JNK-IN-8对于破骨细胞前体细胞(骨髓间充质干细胞)48h生存无明显影响;2.通过TRAP染色发现0.25μM、0.5μM和1μM JNK-IN-8能显著抑制体外RANKL诱导的OCs形成，1μM能明显抑制OCs生存(F=91.08，P＜0.01);3.Real-Time PCR发现JNK-IN-8呈剂量依赖性抑制RANKL诱导的TRACP、CTR、NFACT1、CTSK;4.Western blot检测JNK-IN-8(1μM)抑制JNK磷酸化以及JNK-1/2/3，JNK-IN-8能显著抑制JNK相关分子;5.对于c57小鼠OVX模型处理后发现，JNK-IN-8能抑制去卵巢c57小鼠的骨质疏松的进展;6.对小鼠的骨组织应用Real-Time PCR技术验证发现RANKL诱导而成的破骨细胞相关基因有抑制作用。
　　研究结论:1.JNK-IN-8能抑制体外RANKL诱导RAW264.7细胞以及BMMSc分化形成破骨细胞，并抑制其破坏骨质的能力。2.JNK-IN-8通过抑制JNK酸化，下调OCs相关基因表达，抑制RANKL诱导的OCs活化。3.JNK-IN-8能抑制c57小鼠OVX模型中骨质的吸收和骨质疏松的发生。4.JNK-IN-8可作为潜在药物被使用在的骨丧失相关疾病的抑制剂治疗方案中。

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