• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文学位 >利用原代间充质干细胞在体外构建组织工程化阴茎海绵体
【6h】

利用原代间充质干细胞在体外构建组织工程化阴茎海绵体

代理获取
页面导航
  • 目录
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：阴茎海绵体脱细胞支架的建立与生物学特性的检测

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

五、结论

附图

第二部分 利用原代间充质干细胞在体外构建组织工程化阴茎海绵体

一、实验设计

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、讨论

六、结论

附图

参考文献

综述 阴茎再生的研究进展

攻读博士学位期间发表论文情况

致谢

SCI论文1

SCI论文2

展开▼

摘要

阴茎是男性重要的生殖器官，但阴茎先天性疾病、肿瘤、外伤等因素常常会导致阴茎功能的丧失甚至阴茎的缺失，这不仅影响到患者的生活质量，还会对患者的心理造成巨大创伤。因此，阴茎再生日益受到患者和医生的高度重视。阴茎再生主要有阴茎重建及阴茎移植两种方法。阴茎重建手术主要选用不同类型的皮瓣、自体肋软骨以及合成材料等进行重建手术，但重建后的阴茎功能不完善且易发生感染、坏死等严重并发症，并且，其构建的阴茎组织功能不能完全恢复。阴茎移植手术过程繁琐复杂，组织来源受限，并且患者易发生生理及心理排斥。为了减少甚至消除这些并发症，利用具有创伤小、无免疫排斥、来源广泛的组织工程化阴茎海绵体来解决阴茎再生的难题获得了广泛关注。因此，我们拟用兔为模型，以脱细胞支架为载体，利用原代兔骨髓间充质干细胞在体外构建组织工程化阴茎海绵体，为阴茎再生提供理论依据。
　　脱细胞支架是正常组织去除细胞成分后富含胶原的细胞外基质，它是一种具有立体结构，并保留部分功能的组织支架，种植种子细胞后，其能够与脱细胞支架的结构和功能蛋白相互作用。细胞外基质是细胞微环境的一部分，是细胞生存的“土壤”条件之一，在其中“种植”新的细胞，从而使组织或器官获得再生是近年来组织再生研究的重点。组织工程化阴茎海绵体的构建就是应用此项技术，将阴茎海绵体去细胞化处理获得阴茎海绵体脱细胞支架，随后将相对应的种子细胞种植到海绵体脱细胞支架进行再细胞化，从而获得有功能的阴茎海绵体组织。
　　脱细胞支架之所以能在再生医学中扮演如此重要的角色，是由于其保留的成分通过以下几种方式进行组织再生和修复:(1)为细胞贴附、生长、分化提供立体支架;(2)保留细胞生存及分化的细胞因子;(3)调节信号通路。脱细胞支架成分包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型胶原蛋白、蛋白多糖、透明质酸、硫酸软骨素、层粘连蛋白等。另外，还含有促进细胞生长分化的多种活性因子成分如VEGF、IGFs、EGF等。脱细胞支架因其组织相容性好、具备细胞存活的必要条件（蛋白质和多糖类）、保留细胞因子以及能够诱导干细胞向成体细胞分化的特点，因此为器官再生提供了一个良好的平台。
　　成功获得脱细胞支架后，下一步是需要确定合适的种子细胞对其进行再细胞化。目前应用脱细胞支架进行器官再生的研究中，种子细胞的选用都是问题的关键。Anthony Atala的团队利用平滑肌细胞和内皮细胞作为种子细胞对脱细胞支架进行再细胞化，Song Lujie的团队则是利用的脐动脉内皮细胞作为种子细胞。他们对构建的组织工程化阴茎海绵体通过海绵体测压、器官浴、交配实验等检测发现其能恢复阴茎的部分功能，但是和正常阴茎海绵体组织相比还是有很大差距。阴茎海绵体组织内含有内皮细胞、平滑肌细胞、阴茎白膜细胞、成纤维细胞以及肌源性干细胞等多种细胞。由于内皮细胞、平滑肌细胞、脐动脉内皮细胞不能再分化，种类单一，这可能是组织工程化阴茎海绵体功能不能完全恢复的一个原因。并且，每种细胞的培养方式不尽相同，种植多种细胞增加了感染风险及技术难度。对此，干细胞则成为了组织工程种子细胞的首要选择，但胚胎干细胞的成瘤性及伦理宗教问题限制了其在临床的应用。骨髓间充质干细胞具有取材简单，多项分化潜能，无成瘤性及伦理问题，使其成为构建组织功能化阴茎海绵体非常有前景的种子细胞。
　　基于上述分析，我们拟利用兔为模型，利用原代骨髓间充质干细胞为种子细胞，在体外构建组织工程化阴茎海绵体。本研究的顺利进行，证实了体外用骨髓间充质干细胞构建组织工程化阴茎海绵体的可能性，将体外构建组织工程化阴茎海绵体技术向前推进了一步。
　　第一部分 阴茎海绵体脱细胞支架的构建及生物学特性的检测
　　目的:
　　建立阴茎海绵体脱细胞支架的流程，获取可以用来构建组织工程化阴茎海绵体的脱细胞支架
　　方法:
　　1.阴茎海绵体组织的获取:实验动物选取雄性4月龄新西兰大白兔，体重在2.5-3kg，空气栓塞处死。彻底消毒后，暴露阴茎海绵体组织，在阴茎脚处剪断，去除多余的肌肉组织，取出阴茎海绵体。
　　2.阴茎海绵体脱细胞支架的构建:
　　将阴茎海绵体组织切成4mm，双蒸水持续震荡24小时使细胞初步裂解，换用1％TritonⅩ-100和0.1％氨水持续震荡14天，每12小时换液一次，随之换用PBS处理24小时，最后用DMEM/F12培养基处理24小时。随机选取脱细胞组织块进行HE以及DAPI染色，观察脱细胞的状况。
　　3.阴茎海绵体脱细胞支架的生物学鉴定:
　　(1)形态学检测:应用Masson染色和HE染色观察阴茎海绵体脱细胞支架中细胞的去除以及胶原的保留状况。
　　(2)分子生物学检测:应用DNA检测试剂盒检测阴茎海绵体组织脱细胞前后DNA含量的变化;应用胶原检测试剂盒检测阴茎海绵体组织脱细胞前后胶原含量的变化;应用ELISA的检测方法检测阴茎海绵体组织脱细胞前后VEGF、IGF-1等生长因子含量的变化。
　　(3)显微结构检测:应用透射电镜检测阴茎海绵体组织脱细胞前后显微结构的变化。
　　结果:
　　1.肉眼观:阴茎海绵体组织经过TritonⅩ-100处理及PBS漂洗后，颜色变为白色，较正常组织更加柔软。
　　2.HE及Masson染色:结果显示细胞核已经被彻底去除，胶原保留较完整。
　　3.分子生物学检测:阴茎海绵体在脱细胞后残余DNA含量低于正常组织的5％以下，达到了组织再生要求的低于50ng/mg;阴茎海绵体在脱细胞后胶原含量较正常组织变化不明显;ELISA对VEGF和IGF-1的结果显示阴茎海绵体脱细胞支架仍存在部分VEGF和IGF-1，但是和正常组织相比有所下降。
　　4.透射电镜:阴茎海绵体脱细胞支架内无细胞及细胞碎片，胶原的显微结构和正常海绵体组织差异不明显。
　　结论:
　　我们应用TritonⅩ-100处理阴茎海绵体组织，成功获得了可用于构建组织工程化阴茎海绵体的脱细胞支架。
　　第二部分 利用原代间充质干细胞体外构建组织工程化阴茎海绵体
　　目的:
　　应用原代骨髓间充质干细胞对阴茎海绵体脱细胞支架进行再细胞化，并对间充质干细胞的分化进行鉴定。
　　方法:
　　1.原代骨髓间充质干细胞利用Percoll分离液方法获取，扩大培养，应用流式细胞技术对CD90、CD105、CD44、CD14、CD34、CD45等marker进行鉴定，并进行成脂、成骨、成软骨诱导。
　　2.将骨髓间充质干细胞消化、离心、重悬，调整其密度为30*106个/ml，对脱细胞支架进行多点穿刺注射，静止培养6h。
　　3.将再细胞化的阴茎海绵体脱细胞支架放置于37℃的孵箱内的摇床上，转速为40RPM，培养基24小时更换，持续培养14天。每两天随机抽取标本HE染色检测细胞的生长状况。
　　4.干细胞分化鉴定:培养14天后的组织工程化阴茎海绵体首先应用HE染色，观察细胞的分布及状态;再应用免疫荧光、RT-PCR、WB等技术对内皮细胞及平滑肌细胞的marker例如CD31、vWF、myosin、α-SMA进行鉴定，并通过透射电镜直接观察细胞的状态及类型。
　　5.增殖检测:应用EdU增殖检测试剂盒对种植在阴茎海绵体脱细胞支架内的间充质干细胞进行增殖检测。
　　结果:
　　1.通过对获取的骨髓间充质干细胞的鉴定，CD90、CD105、CD44阳性率在95％以上，CD14、CD34、CD45阳性率低于2％，并且对间充质干细胞成骨、成软骨、成脂的诱导后，分别经碱性磷酸酶、阿尔新蓝、油红O染色结果均为阳性。
　　2.组织工程化阴茎海绵体体外培养14天后，HE染色结果显示:细胞在脱细胞支架内贴壁生长，状态良好，分布均匀。
　　3.通过对组织工程化阴茎海绵体内的细胞进行荧光鉴定，发现部分细胞表达内皮细胞的标志物如CD31和vWF，部分细胞表达平滑肌细胞的标志物如myosin和α-SMA，表明间充质干细胞向内皮细胞及平滑肌细胞进行分化。RT-PCR及WB均证实了上述结果。
　　4.显微结构:透射电镜直接观察到内皮细胞和平滑肌细胞。
　　5.增殖检测结果:种植到脱细胞支架内的间充质干细胞在支架内进行了增殖。
　　结论:
　　兔骨髓间充质干细胞可以作为种子细胞成功的在体外构建组织工程化阴茎海绵体，间充质干细胞可以在脱细胞支架内分化为内皮细胞和平滑肌细胞。本研究证实了体外用骨髓间充质干细胞构建组织工程化阴茎海绵体的可能性，并将体外构建组织工程化阴茎海绵体技术向前推进了一步。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号