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骨膜素对子宫内膜间质细胞迁移、侵袭、粘附的调控及其机制研究

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摘要

符号说明

前言

材料与方法

1．材料

2．方法

3．统计学分析

实验结果

1．ESCs的鉴定及其纯度

2．PN、ILK1及p-Akt在NSCs、EuSCs、EcSCs中的表达情况

3．PN对ILK1及p-Akt表达水平的影响

4．PN对ESCs迁移、侵袭、粘附及增殖的影响

讨论

1．ESCs的鉴定及其纯度的研究

2．PN、ILK1及p-Akt在NSCs，EuSCs，EcSCs中表达情况的研究

3．PN对ILK1及p-Akt表达水平的影响

4．PN对ESCs迁移、侵袭、粘附及增殖的影响

结论

附图

参考文献

致谢

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摘要

研究背景及目的:
　　子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是一种常见的妇科良性疾病，其发病率约占生育年龄女性的10％，治疗方式主要包括腹腔镜及促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)、芳香化酶抑制剂及孕酮等药物治疗，但术后仍有较高的复发率，长期使用药物会引起许多副反应。而且，EMs与恶性肿瘤及许多慢性病的发生有关，因此寻找一有效的治疗靶点至关重要。目前，EMs的发病机制尚不明确，但Sampson的经血逆流学说仍占主导地位，近年郎景和院士提出的在位内膜决定论为EMs的发病机理做出了补充说明，即子宫内膜碎片的异位粘附、侵袭及血管形成。骨膜素(periostin，PN)是成束蛋白I家族的成员，在成体组织中低表达，但在肿瘤、损伤及炎症中起到至关重要的作用，高水平的PN可以促进肿瘤细胞粘附、侵袭、迁移及增殖。我们前期研究已表明PN在EMs的在位及异位内膜间质中高度表达，而在EMs病理生理过程中所起的作用尚未研究。本文通过检测PN对子宫内膜间质细胞(ESCs)粘附、迁移、侵袭及增殖能力的影响，进一步探索PN在EMs发生过程中的机制。
　　方法:
　　1.收集25例正常女性的子宫内膜，32例EMs患者的在位内膜及异位内膜，分离并纯化子宫内膜间质细胞，通过细胞免疫荧光法鉴定其来源及纯度。
　　2.用Western blot的方法分别检测正常子宫内膜间质细胞(NSCs)、子宫内膜异位症在位(EuSCs)及异位内膜间质细胞(EcSCs)中PN、整合素连接激酶1（integrin-linked kinase1，ILK1）、p-Akt的表达，比较三种蛋白的表达差异;通过实时定量PCR(qPCR)检测，分析三组细胞中PN mRNA的表达情况。
　　3.PN siRNA干扰后分别检测PN、ILK1、p-Akt蛋白水平的变化。
　　4.PN siRNA干扰后检测细胞粘附、迁移、侵袭及增殖等生物学行为的改变。
　　结果:
　　1.ESCs的鉴定及其纯度:采用胶原酶消化、筛网过滤法，成功地分离并纯化ESCs，经鉴定所培养的细胞绝大部分为间质细胞，其纯度是（96.1±2.2）％。
　　2.PN、ILK1及p-Akt在NSCs、EuSCs、EcSCs中的表达情况:与NSCs相比，EuSCs及EcSCs中PN蛋白及mRNA的表达水平上调，但NSCs与EuSCs中PN mRNA表达无差异;在EuSCs及EcSCs中，ILK1和p-Akt的表达增加(P＜0.05)。
　　3.PN对ILK1及p-Akt表达水平的影响:PN siRNA干扰后，PN、 ILK1、p-Akt的表达均下调（P＜0.05）。
　　4.PN对ESCs迁移、侵袭、粘附及增殖的影响:EuSCs及EcSCs的迁移及侵袭能力较NSCs增强(P＜0.01;P＜0.001)，PN siRNA干扰后，EcSCs的迁移及侵袭能力下降（P＜0.05;P＜0.01）;EcSCs的粘附速率最快(P＜0.05)，PNsiRNA干扰的EcSCs与纤维连接蛋白(FN)相互作用60mins后，粘附能力下降明显(P＜0.05)，EcSCs之间纤维连接增多，PN siRNA干扰后，细胞之间纤维样物质溶解;EuSCs与EcSCs的增殖能力较强，但是差异无统计学意义(P＞0.05)，PN siRNA转染后，EcSCs增殖能力无明显变化。
　　结论:
　　1.胶原酶消化、筛网过滤法分离培养的ESCs纯度较高，NSCs、EuSCs及EcSCs的来源均为子宫内膜间质。
　　2.PN通过激活ILK1/Akt信号通路促进ESCs迁移、侵袭及粘附，PN还能够促进细胞间纤维样物质生成。
　　3.PN可能是治疗EMs的新型靶点。

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