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混合型布加综合征人工血管转流术后移植物-静脉吻合口再狭窄的临床与实验研究

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摘要

研究背景：
　　 布加综合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）是指肝静脉主干和／或肝后至右心房段之间下腔静脉全部或部分阻塞，导致静脉回流障碍所引起的脏器组织淤血受损的临床症候群。是一类自然预后极差，严重威胁人类健康的疾病。近年来，随着人们对该病认识程度的加深、医疗诊治技术的不断发展和影像学检查的广泛应用，临床报道了大量病例。各国学者对布加综合征流行病学、病因学、病理学及分子生物学等基础理论的研究不断深入，同时开展合理的手术及多学科综合治疗，使布加综合征的总体治疗水平明显提高，但目前仍存在许多尚未了解和解决的难点及问题。
　　 我国是布加综合征的高发区，年发病率为4-6/10万，中青年男性患者居多，病变类型以下腔静脉隔膜性梗阻(Membranous obstruction of the inferior vena cava，MOVC)或血栓性短段狭窄或闭塞为主，治疗手段首选介入方法，即经皮腔内血管扩张成形术(Percutaneous transluminal angioplasty，PTA)或同期金属支架置入术(simultaneous embedded metal stent，EMS)。介入治疗以其创伤小，见效快，实施便捷等优点在我国布加综合征的临床治疗中得到了广泛的应用。然而，对于介入术中无效或者术后再狭窄、合并肝静脉主干阻塞、下腔静脉长段狭窄及隔膜下继发长段血栓等这类出现介入并发症或混合型布加综合征的病例，各种分／转流减压手术可作为良好的补救和备选治疗方案。决定该类外科手术成败的关键是分／转流通道的长期通畅。既往研究显示，无论利用自身静脉或各种人工血管作为移植物建立分／转流通道，移植物-吻合口再狭窄或闭塞是导致分／转流通道功能丧失的主要原因。既往的研究多集中于外周动脉硬化闭塞症(peripheral artery occlusive disease PAOD)及冠状动脉硬化狭窄性心脏病(coronary arteriosclerotic heart disease，CASHD)等动脉疾病，而在布加综合征的治疗中对阻塞静脉行分／转流手术后移植物-静脉吻合口的再狭窄或闭塞的防治问题，目前尚未见到系统的实验研究和临床报道。本研究收集并回顾性分析—组复杂混合型布加综合征的临床资料，对比利用膨体聚四氟乙烯(Expandedpolytetrafluoroethylene，ePTFE)人工血管先后实施的两种不同的主要转流术式，显示充分的减压转流可以收到更佳的临床疗效，近期或远期的主要并发症是移植物-静脉吻合口再狭窄或闭塞导致转流通道功能丧失，进而诱发肝衰竭的发生甚至死亡。如何降低布加综合征人工血管转流术后移植物-静脉吻合口再狭窄或闭塞的发生率，从而保持人工转流通道的长期通畅，是目前困扰外科医生的需要迫切解决的临床问题，也是肝胆血管外科基础研究中的热点之一。本研究在观察对比两种利用ePTFE人工血管转流手术治疗混合型布加综合征的临床疗效基础上，重点分析和总结术后移植物-静脉吻合口再狭窄的各种危险因素，为后续的实验和基础研究提供针对性的研究方向。
　　 目前研究显示，静脉再狭窄的发生机制较之动脉更为复杂，主要与血管壁细胞损伤应激及血流动力学变化等有关，尤其是内皮细胞的损伤及引发的级联反应在吻合口再狭窄的发生过程中起到关键的作用。既往的研究主要集中于内皮细胞损伤后的后续反应，如平滑肌细胞的增值迁移，纤溶系统激活等，但是对于内皮细胞损伤的自身变化及如何预防和修复内皮细胞损伤这些起始因素和上游事件，目前尚无系统的基础实验研究。内皮细胞作为血管壁内膜的第一道屏障，不仅仅起到保持血管壁完整光滑的物理作用，还可以分泌很多细胞因子从而维护自身和相邻组织细胞的良好功能。其中一氧化氮(Nitric Oxide，NO)是极为重要的调控因子之一，它具有扩张血管、抑制血小板和白细胞粘附及平滑肌细胞的增殖迁移，促进内皮细胞存活和修复的作用，是内皮细胞发挥正常生理功能的关键因子。内皮型一氧化氮合成酶(endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS)是NO合成的关键酶，主要在血管内皮表达，是血管系统内源性NO的主要来源。本研究中通过建立急性下腔静脉阻塞型布加综合征的大鼠动物模型，动态监测静脉血中NO的含量变化及eNOS在局部血管壁组织中的表达情况，分析在急性下腔静脉阻塞型布加综合征发生过程中NO含量及eNOS表达的变化规律，评估内皮细胞损伤后自身各种变化的状况，为以后开展预防和修复内皮细胞损伤，保护其功能的研究提供一定的理论依据和实验基础。
　　 血管内皮的损伤和修复是近几年临床和基础研究的热门方向。既往的研究多集中于通过内源性途径（如基因改良及细胞结构重组工程等）改善和增强细胞自身的功能，但在实际操作中周期冗长，步骤繁琐，设备材料及人员专业水平要求较高，研究经费高昂。外源性途径则有效减缓了以上难度，也获得了良好的实验效果。本研究中我们应用外源性的一氧化氮供体(sodium nitroprusside，SNP硝普钠)干预体外培养的不同状态的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical veinendothelial cell,HUVEC)，观察内皮细胞形态及重要功能指标的变化，分析一氧化氮促进内皮细胞损伤修复的主要途径，并对其发挥作用的分子生物学机制尝试探讨，为研发有效的临床一线药物，更好地预防和治疗布加综合征人工血管转流术后移植物-静脉吻合口再狭窄提供新思路，新途径。
　　 第一部分：
　　 两种人工血管转流术治疗复杂混合型布加综合征的临床疗效对比观察及移植物-静脉吻合口再狭窄的相关因素分析
　　 目的:观察比较应用ePTFE人工血管分别行肠-房转流术(MAS)和肠-腔-房转流术(MCAS)治疗复杂混合型布加综合征的临床效果，分析总结术后移植物-静脉吻合口再狭窄导致人工血管功能丧失的原因与相关机制。
　　 方法:回顾性分析1998年10月至2003年8月收治的29例混合型布加综合征手术患者的临床资料，为全部或两支肝静脉主干阻塞且肝后下腔静脉长段血栓形成或长段闭塞或狭窄。其中12例应用ePTFE人工血管行肠-房转流术(MAS)，17例行肠-腔-房转流术(MCAS)。比较分析两组患者手术前后的临床症状、下腔静脉及门静脉压力、术后并发症发生率、移植物-静脉吻合口狭窄情况、人工血管通畅率及术后生存率等。
　　 结果:两组患者中MAS组发生1例围手术期死亡。术后随访3天-60月，失访1例，随访率96.6％。MAS组与MCAS组术后临床症状缓解率分别为54％和90.8％;并发症发生率分别为12.5％和1.8％;门静脉及下腔静脉压力平均下降分别为15.5mm水柱、62.4mm水柱和12.3mm水柱、184.7mm水柱。MAS组中4例术后1年内因人工血管阻塞致肝功能衰竭死亡，MCAS组中1例术后4.5年人工血管堵塞致肝功能衰竭死亡。两组患者术后均发现移植物-静脉吻合口处内膜增生，MAS组中移植物-肠系膜上静脉(G-SMV)吻合口1，3，5年总狭窄率分别为66.7％、75％、83.3％;MCAS组中G-SMV吻合口总狭窄率分别为47.1％、58.8％、64.7％;移植物-下腔静脉(G-IVC)吻合口总狭窄率分别为35.3％、41.2％、58.8％。两组患者术后1、3、5年生存率分别为41.7％、41.7％、16.7％和94.1％、88.2％、82.4％。5年人工血管通畅率分别为41.7％和94.1％。对比两组数据，除门静脉压力外，余均有显著性差异(P＜0.05)，MCAS组优于MAS组。
　　 结论:1，MCAS通道行径更加符合人体血流动力特点，可同时缓解混合型布加综合征的门静脉高压和下腔静脉高压，术后降压效果明显，并发症少，人工血管可保持远期通畅，患者5年生存率更高。
　　 2，影响人工血管通畅的主要原因是移植物-静脉吻合口的再狭窄，是决定分流术疗效的关键因素。
　　 3，内膜增生是导致移植物-静脉吻合口再狭窄的主要因素。
　　 第二部分：
　　 一氧化氮含量及内皮型一氧化氮合成酶表达在急性布加综合征大鼠模型中的动物实验研究
　　 目的:建立稳定的大鼠急性下腔静脉阻塞型布加综合征的动物模型;检测大鼠血浆NO含量及肝上下腔静脉局部血管壁组织中eNOS的表达水平。
　　 方法:选取成年Wistar雄性大鼠为模型动物，分为正常对照组10只（未手术组），手术练习组10只和手术实验组60只（每组20只）。采用改良的肝上下腔静脉缩窄法结扎血管，计算手术时间，分别于术后1、7及14天处死手术实验组各组动物，观察腹腔脏器大体变化，测量肝下下腔静脉及门静脉压力，采集静脉血检测肝功指标变化，称重肝脾并分别切取部分组织制作HE切片，观察病理变化。应用硝酸还原酶法检测静脉血血浆中NO的含量及免疫组化法观察比较肝上下腔静脉局部血管壁组织中eNOS的表达情况。
　　 结果:手术练习组大鼠围手术期死亡4只，余术后良好存活2周以上;正常对照组及手术实验组大鼠无围手术期死亡，生存良好。实验组手术操作时间为15.3±3.6分钟，无意外出血。术后1、7、14天处死动物，随时间延长，腹腔脏器粘连渐加重，腹水形成，可见腹壁下侧枝浅静脉显现，肝脾渐充血肿大，质地变硬，肝脾脏器系数递增;肝功能主要指标转氨酶逐渐增高，下腔静脉压及门静脉压递增，以上各类数据与正常组对照，及组间比较均具有统计学差异(P＜0.05);肝脾HE染色观察显微结构符合肝硬化门脉高压症时的病理演变过程特点。术后1、7、14天检测静脉血血浆中NO含量分别为67.18±4.23、84.70±3.26和132.90±8.05μmol/L，与正常对照，有显著性差异(P＜0.05);组间比较，亦有显著差异(P＜0.05);正常对照组中eNOS表达较低，在实验组中阳性表达率明显升高，主要在内皮细胞的细胞膜和细胞浆中表达，随术后时间延长逐渐增多，与对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。血浆NO含量与血管壁eNOS表达在实验周期观察范围内，呈正相关。
　　 结论:1，通过改良的肝上下腔静脉缩窄法可以成功建立稳定的大鼠急性布加综合征动物模型，制备简单，成模周期短;是目前理想的急性布加综合征动物模型，为后续的研究奠定实验基础。
　　 2，急性下腔静脉阻塞型布加综合征形成过程中，下腔静脉血流瘀滞及局部血管壁内皮损伤导致血浆NO含量水平逐渐增高，eNOS在局部血管壁内膜组织中的阳性表达比率增加，说明血流动力学变化和内皮细胞自身功能损伤参与病程演变。
　　 3，血浆NO含量水平和局部血管壁内膜组织中eNOS阳性表达率在一定实验观察期内呈正相关，可能存在协同上调的机制。
　　 第三部分：
　　 外源性一氧化氮促进血管内皮细胞损伤修复在防治混合型布加综合征转流术后移植物-静脉吻合口再狭窄中的体外实验研究
　　 目的:观察外源性一氧化氮干预体外培养的正常及损伤模型中的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后内皮细胞的形态变化及功能修复的状况，探讨一氧化氮功能与内皮细胞损伤的关系及其促进损伤修复的主要途径和调控机制，为防治混合型布加综合征转流术后移植物-静脉吻合口再狭窄的基因治疗及临床用药提供可靠的实验依据。
　　 方法:1，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养和鉴定;
　　 2，H2O2诱导HUVEC损伤模型的建立;
　　 3，外源性一氧化氮供体SNP干预HUVEC损伤模型的制备;
　　 4，外源性一氧化氮对人脐静脉内皮细胞损伤影响的相关检测。
　　 (1)实验分组:正常HUVEC组（正常组），H2O2诱导HUVEC损伤模型组（损伤组），SNP干预H2O2诱导HUVEC损伤模型组（干预组）;
　　 (2)光镜观察比较各组细胞外观形态学改变的差异:
　　 (3)Hoechst33258蓝色荧光染色后观察比较各组细胞核凋亡改变的差异;
　　 (4)WesternBlot法检测比较各组细胞eNOS蛋白表达水平，了解NO调节eNOS合成的变化;
　　 (5)WesternBlot法检测各组细胞内凋亡相关基因Caspase-7蛋白表达水平，了解损伤细胞抗凋亡能力变化;
　　 (6)ELISA检测比较各组细胞培养基上清液中VEGF含量，了解损伤细胞分泌功能变化;
　　 (7)免疫组织化学法检测比较各组细胞PCNA表达差异，了解损伤细胞增殖功能变化。
　　 结果:1，正常HUVEC在H2O2诱导下发生氧化应激反应性损伤，细胞形态发生改变，出现凋亡小体;干预组细胞形态基本正常，凋亡小体明显减少;
　　 2，损伤组eNOS蛋白表达水平降低，干预组eNOS表达回升，接近正常组含量;
　　 3，正常组未见Caspase-7蛋白表达，损伤组可检测到明显表达，干预组表达量显著减少;
　　 4，干预组VEGF含量高于正常组和损伤组，与损伤组有显著性差异(P＜0.05):
　　 5，干预组PCNA表达与正常组无明显差异，较损伤组表达明显增高，有显著性差异(P＜0.05)。结论:1，在氧化应激的条件下，内皮细胞受损，损伤后形态失常，eNOS基因表达水平降低，抗凋亡能力下降，增殖、合成及分泌功能均减退;
　　 2，在一定剂量外源性一氧化氮干预下可提高内皮细胞中eNOS基因的自身合成，促进损伤内皮细胞形态的修复，抑制凋亡发生以及保护损伤内皮细胞的增殖、合成及分泌等重要功能。

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