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可改善蛋白质和核酸类药物功效的壳聚糖衍生物纳米给药系统

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通过自由基共聚合反应,修饰壳聚糖的氨基并制备一系列新型壳聚糖衍生物纳米粒。以胰岛素、DNA乙肝疫苗和蛋白质乙肝疫苗为模型药物,研究壳聚糖衍生物纳米粒的理化性质、载药特点、体外释药规律、体内递药及改善药物功效等特性。
　　 1、甲基丙烯酸衍生物共聚物纳米粒的制备和表征
　　 运用自由基聚合法将疏水性的甲基丙烯酸甲酯(MMA)分别与亲水性的甲基丙烯酸(MAA)、异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(TMAEMC)和甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEMC)共聚合,制得疏水核心、亲水表面的两亲性纳米粒,对纳米粒的粒径、表面电荷和抑酶作用等进行表征。结果表明纳米粒粒径较小、分布均一,稳定性较高,对蛋白酶活性有一定的抑制作用。通过考察反应时间、亲水聚合物单体浓度、聚合单体总浓度、引发剂浓度、离子强度和pH值对纳米粒粒径大小和表面电荷的影响,确定制备工艺。
　　 2、壳聚糖衍生物纳米粒的制备和表征
　　 运用自由基聚合反应原理,在壳聚糖的氨基位接枝季铵盐等活性基团,共聚合产生的接枝共聚物在水中自发形成疏水核心、亲水表面的两亲性纳米粒。红外光谱(FTIR)1652cm-1处吸收峰的消失和1637cm-1处新的吸收峰的出现、核磁共振(1H-NMR)δ=3.2ppm质子化学位移峰的出现,均表明TMAEMC的季铵(-N+(CH3)3)基团已连接至壳聚糖氨基。纳米粒粒径分布均一、表面电位较强(大于15mV)、稳定性较高。
　　 3、壳聚糖衍生物纳米粒用于胰岛素的口服给药
　　 以壳聚糖-甲基丙烯酸甲酯(CM)、壳聚糖-甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯-甲基丙烯酸甲酯(CDM)和壳聚糖-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵-甲基丙烯酸甲酯(CTM)纳米粒为给药载体,胰岛素为模型药物,对载胰岛素纳米粒的包封率、体外释放、降血糖效果等分别进行考察。胰岛素通过与纳米粒表面的正电荷亲水链之间的离子相互作用包载至纳米粒,包封率随纳米粒浓度的增加而升高;胰岛素的释放是通过其在纳米粒表面亲水链的解离扩散实现的,释放速率由胰岛素和亲水链间相互作用力的大小决定;上述三种纳米粒中,CTM纳米粒的表面电荷较高,与胰岛素的离子相互作用力较大,故胰岛素的解离和释放速率较慢。圆二色谱测定结果表明纳米粒对胰岛素的包载不会对其高级结构造成显著影响。
　　 采用大鼠口服和十二指肠给药方式分别考察载胰岛素纳米粒的降血糖效果。口服给药试验中,载胰岛素的CM、CDM和CTM纳米粒均有一定程度的降血糖作用。给药(100u·kg-1)2h后,血糖开始下降,8h至10h血糖值降至最低,CM、CDM和CTM纳米粒给药组的血糖值分别约为初始值的80％、75％和65％。十二指肠给药1h后,血糖开始下降,4h左右血糖值降至最低,CTM纳米粒给药组的给药剂量为50u·kg-1和100u·kg-1时,最低血糖值分别约为初始值的72％和65％。上述两种给药方式中,胰岛素PBS对照组均无明显的降血糖作用。采用口服给药考察载胰岛素CTM纳米粒对糖尿病模型大鼠的降血糖效果,给药剂量为100u·kg-1时,给药2h后血糖值降至初始值的25％左右,试验结果表明,载胰岛素CTM纳米粒可显著降低糖尿病模型大鼠的血糖水平,降血糖效果随胰岛素给药剂量的增高而逐渐增强。
　　 4、壳聚糖衍生物纳米粒用于提高乙型肝炎核酸疫苗免疫原性
　　 以聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(TM)、CM、CDM和CTM纳米粒为给药载体,pVAX(HBc)为模型疫苗,测定载DNA疫苗纳米粒诱导机体体液、细胞免疫的能力。DNA疫苗不需经有机溶剂处理、超声、剧烈搅拌等过程即可包载至纳米粒。与空白纳米粒相比,DNA纳米粒具有暗色的外壳和淡色的核心部分,粒径略微增大,表明DNA已结合至纳米粒表面的亲水链,形成核心.外壳结构。CM、TM、CDM和CTM纳米粒对脱氧核糖核酸酶Ⅰ的活性都有一定的抑制作用,其中CTM纳米粒的抑制作用最强,与脱氧核糖核酸酶Ⅰ培育10min后,酶活力下降为初始值的32.2％。体内免疫试验表明,CDM和CTM纳米粒免疫组可有效提高特异性抗体的表达量、IFN-γ分泌量及CTL细胞的杀伤毒性。
　　 5、壳聚糖衍生物纳米粒用于蛋白质乙肝疫苗给药
　　 以TM、CDM和CTM纳米粒为给药载体,乙肝病毒核心抗原(hepatitis B virus core protein,HBCM)为模型疫苗,HLA-A2.1转基因小鼠为模型动物,对纳米粒提高重组蛋白疫苗的体内免疫水平和相关作用机理进行研究。HBCM的等电点为5.1,在PBS(pH7.4)溶液中带有明显的负电荷,可被带正电荷的纳米粒吸附,包载至纳米粒的亲水链之间。当纳米粒和HBCM的浓度为10mg·ml-1和50μg·ml-1时,TM,CDM和CTM纳米粒对HBCM的包封率分别为85.7％,94.2％和96.9％。与空白纳米粒相比,载HBCM纳米粒形成核-壳结构,粒径略微增大,表明HBCM已被纳米粒表面的亲水链包载。共聚焦显微观察试验结果表明,纳米粒可促进蛋白质被RAW264.7细胞吸收,并影响其在细胞内的分布。体液和细胞免疫研究结果表明,载HBCM壳聚糖衍生物纳米粒可显著提高蛋白质疫苗的免疫原性,包括增加特异性抗体的含量和分泌细胞的数量,提高CTL细胞毒性和特异性CD8+T细胞的比例。
　　 6、PEG修饰的壳聚糖季铵盐的制备、表征及其在DNA疫苗给药中的应用
　　 通过PEG修饰技术,制得三甲基铵壳聚糖-mPEG(TMC-mPEG);带正电荷的TMC-mPEG与带负电荷的DNA疫苗通过静电相互作用自组装形成稳定的纳米复合物,考察其在体液和细胞免疫方面的作用。TMC由壳聚糖和TMAEMC经自由基引发剂的催化共聚合而成。mPEG-羧酸能与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCCI)反应,生成酯化的mPEG衍生物(mPEG-SCM)。mPEG活化后,其亲电基团能与TMC的亲核性氨基连接,生成TMC-mPEG共聚物。核磁共振δ=3.2ppm三甲基铵(-N+(CH3)3)和δ=3.3ppm甲基氧(CH3O-)的质子化学位移峰的出现,表明三甲基铵和mPEG已连接至壳聚糖的主链。壳聚糖的三甲基铵化程度为46.2％,mPEG化的程度为36.9％。
　　 调整共聚物与pVAXq(HBc)的比例可制得不同粒径和包封率的DNA疫苗纳米粒。当TMC-mPEG与pVAX(HBc)为5:1时,制得的纳米粒较稳定,30d内无凝聚物或沉淀物产生,平均粒径为215.1±6.4nm,包封率为92.0％。体液和细胞免疫研究结果表明,载DNA疫苗TMC和TMC-mPEG免疫组均能显著提高小鼠特异性抗体的含量和分泌细胞的数量。考虑到TMC具有一定程度的细胞毒性,生物相容性较好的TMC-mPEG共聚物有望成为较优的DNA疫苗载体。
　　 7、壳聚糖共聚物的安全性评价
　　 研究纳米粒或共聚物的细胞毒性、血液相容性、对肌肉组织的损伤、对小肠组织及细胞的损伤、急性毒性等,从细胞、组织及整体动物水平考察相关材料的安全性。细胞存活率和血液相容性随纳米粒或共聚物的浓度和表面电荷的增加而逐渐降低。TMC-mPEG显示较低的细胞毒性和溶血率,浓度为800μg·ml-1时,细胞存活率可达90％;浓度为2000μg-ml-1时,溶血率为7.1％。肌肉、小肠组织切片观察表明纳米粒或共聚物对肌肉、小肠组织几乎无损伤。小肠细胞损伤试验表明,TMC共聚物对小肠细胞有一定的损伤,而PEG修饰可明显降低阳离子聚合物对小肠细胞的损伤。口服CTM和CDM纳米粒的LD50值大于2.4g·kg-1,耐受倍数为240:口服TMC和TMC-mPEG共聚物的LD50值大于1.2g·kg-1,耐受倍数为120。纳米粒和共聚物的动物耐受剂量倍数均超过100。

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