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【6h】

1.人巨噬细胞金属弹性蛋白酶在胃癌细胞及胃癌组织中的表达及临床意义;2.胃癌和结肠癌患者二氢嘧啶脱氢酶基因多态性与5-FU代谢及临床意义探索

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第一部分人巨噬细胞金属弹性蛋白酶在胃癌细胞及胃癌组织中的表达及临床意义

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第二部分胃癌和结肠癌患者二氢嘧啶脱氢酶基因多态性与5-FU代谢及临床意义探索

一、胃癌和结肠癌患者血液中5-Fu药物浓度测定

二、DPYD基因多态性测定

三、 临床资料分析

四、讨论

五、结论

参考文献

综述(一)二氢嘧啶脱氢酶研究进展及在氟脲嘧啶化疗中的意义

综述(二)胃癌相关基因和基因治疗研究进展

攻读学位期间发表的论文

致谢

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摘要

目的人巨噬细胞金属弹性蛋白酶(HME)是MMP家族的一员，又称MMP-12。它有强的降解细胞外基质(ECM)的能力，故可渗透基底膜，侵袭正常和肿瘤组织；但HME同时可把纤维蛋白溶酶原转变为血管抑素(angiostatin)，从而限制血管生成，抑制肿瘤的生长和侵袭。由于HME是MMP中较新的成员，对它的研究尚少，关于它在肿瘤中的表达水平及意义有很多争论。国内无此方面的研究。从国外现有的资料看，它在不同肿瘤中的表达意义不一致。关于胃癌和瑚ME关系的文献国内外均未见报道。本研究测定三株胃癌细胞株(MGC-803、SGC-7901、AGS)和胃癌患者组织标本(包括肿瘤组织、癌旁组织、远处正常组织)中的HME表达水平。使用RT-PCR、荧光定量PCR测定HME基因表达，采用WesternBlot和免疫组化测定HME蛋白表达。分析HME在胃癌患者中表达水平和在胃癌发生和发展中的作用及对预后判断的意义。 材料与方法1.临床资料所有病例取自浙江大学医学院附属第一医院2003年4月～2003年8月间胃肠外科和肿瘤外科胃癌住院手术病人。共58例，其中男性43例，女性15例；年龄最大76岁，最小32岁，平均58.5±10.6岁。所有胃癌患者组织标本均包括肿瘤组织、癌旁组织、远处正常组织。标本离体半小时内采样-200℃液氮保存备用。 2.细胞培养胃癌细胞株MGC-803、SGC-7901、AGS购于中科院上海细胞生物研究所。常规细胞培养，培养基为RPMI1640细胞培养基(美国GIBCO公司)加10％小牛血清(杭州四季青公司)，胃癌细胞株MGC-803、SGC-7901、AGS在含10％小牛血清的培养液RPMI1640中，于37℃、5％CO2条件下培养，每2～3天传代一次。取生长状态良好、达90％融合的细胞作为研究对象。 3.RT-PCR检测HMEmRNA表达总RNA提取：取上述培养细胞和三种组织标本各100mg分别加入Trizol1ml，破碎后的细胞和碾碎后的组织样本分别转移至无RNA酶和无DNA酶的1.5mlEppendorf管，然后根据试剂说明书抽提RNA，最后用DEPC处理水溶解RNA。提取的总RNA经紫外分光光度计测定提取物的浓度，OD260/280比值在1.8-2.0之间。 4.实时荧光PCR检测HMEmRNA表达取上述逆转录反应产物4μl于40μl反应体积中进行Real-timePCR反应。反应体积组成如下：10×Buffer4μl、dNTP10mm/L0.8μl、MgCl225mmol/L2μl、2.5UTaqDNA聚合酶0.5μl、模板4μl、上、下游特异引物各1μl、特异性探针0.3μl，去离子水26.4μl。引物序列为5'-TGAAAGTGACCGGGCAACT-3'和5'-GGATTGCGTAGTCAACATCCTC-3'，探针序列为5'-FAM-ATGCACGCACCTCGATGTGGAGTCC-TAMRA。先94℃变性3min，然后按下述条件循环40次：94℃10s、60℃40s，60℃采集光源。 5.WesternBlot检测HME蛋白表达提取上述培养的细胞，用预温PBS洗涤一次，加入500μlCellLysis，冰上放置10min，用自制细胞刮刮下细胞；癌组织、癌旁组织、正常组织各取100mg，用PBS洗涤一次，加入500μlCellLysis，用玻璃匀浆器研磨； 6.免疫组化检测HME蛋白表达使用Envision二步法行免疫组化分析。切片5微米，脱蜡至水；阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇+2毫升30％H2O2)室温20分钟，水洗；pH7.2缓冲液洗三次；抗原修复液内微波修复20分钟；pH7.2缓冲液洗三次；滴加正常血清，37.0℃，20分钟；擦去多余血清，加兔抗MMP-12多克隆抗体作为一抗，工作浓度为1∶1000，37.0℃，60分钟；pH7.2缓冲液洗三次；滴加Envision二抗，37.0℃，60分钟；pH7.2缓冲液洗三次；DAB显色10分钟；水洗；苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封固。 结果1.胃癌细胞株检测结果胃癌细胞株MGC-803、SGC-7901、AGSHMEmRNA常规RT-PCR检测结果均为阳性。采用实时荧光PCR对三种胃癌细胞株的HMEmRNA进行定量检测，每份样本均根据β-actin的拷贝数进行校正，PCR扩增模板中含106拷贝数β-actin作为内参校准。实时荧光PCR检测结果也均为阳性，上述细胞株中HMEmRNA检测定量值为8.37×105、2.54×105和1.85×104。WesternBlot检测结果显示HME蛋白表达在上述三个细胞株中也为阳性，光密度扫描值分别为3784、2719和3375。 2.临床胃癌组织标本检测结果2.1胃癌组织标本HMEmRNA检测结果(1)RT-PCR对58例胃癌患者癌组织、癌旁组织和正常组织的HMEmRNA进行RT-PCR检测，结果发现癌组织、癌旁组织和正常组织的HMEmRNA阳性率分别为24.14％、20.69％和6.90％，三组间差异有统计学意义，P＜0.05；癌组织阳性率高于正常组织，差异有统计学意义，P＜0.05；癌旁组织阳性率高于正常组织，差异有统计学意义，P＜0.05；癌组织阳性率高于癌旁组织，差异无统计学意义，P＞0.05。PCR扩增产物图象分析表明，HMEmRNA在组织中表达丰度在癌组织中最高，其次分别是癌旁组织和正常组织。 (2)Real-timePCR采用实时荧光PCR对胃癌组织、癌旁组织和正常组织的HMEmRNA进行定量检测，每份样本均根据β-actin的拷贝数进行校正，PCR扩增模板中含106拷贝数β-actin作为内参校准。结果表明胃癌组织、癌旁组织和正常组织的HMEmRNA阳性率31.03％、25.87％、18.97％；癌组织阳性率高于癌旁组织、癌旁组织阳性率高于正常组织，但差异无统计学意义，P＞0.05。阳性结果拷贝数对数值分别为6.06±0.76、3.97±1.42和3.38±0.80，三组间差异有统计学意义，P＜0.01；两两比较，癌组织HMEmRNA表达量显著高于正常组织，差异有统计学意义，P＜0.01；癌组织HMEmRNA表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义，P＜0.01，癌旁组织HMEmRNA表达量高于正常组织，但差异无统计学意义，P＞0.05。 (3)胃癌患者中HMEmRNA的表达与预后的关系根椐Real-timePCR检测的结果，把胃癌患者分为HMEmRNA表达阳性组与阴性组，进行胃癌患者HMEmRNA表达与胃癌患者预后的分析。其中HMEmRNA阳性18例，阴性40例。HMEmRNA表达与否和肿瘤的位置、大小、浸润深度、恶性程度、耐药基因top、耐药基因PGP无关。HMEmRNA阳性患者淋巴结转移发生率小于阴性者，差异有统计学意义(P＜0.05)；HMEmRNA阳性患者GST基因表达阳性率小于阴性者，差异有统计学意义(P＜0.05)；HMEmRNA表达阳性者两年存活率高于表达阴性者，差异有统计学意义(P＜0.05)。 2.2胃癌组织标本HME蛋白检测结果(1)WesternBlot采用WesternBlot技术对胃癌组织、癌旁组织和正常组织的HME蛋白质进行检测，并且对检测结果进行光密度扫描，定量HME蛋白。结果表明胃癌组织、癌旁组织和正常组织的HME蛋白阳性率分别为27.58％、25.87％和24.14％，癌组织阳性率高于癌旁组织和正常组织，但均无统计学意义，P＞0.05。阳性患者HME蛋白定量结果分别为3358±1053、2891±974和2305±915，三组间差异有统计学意义，P＜0.05；两两比较，癌组织HME蛋白量显著高于正常组织，差异有统计学意义，P＜0.01；癌组织HME蛋白量高于癌旁组织，癌旁组织高于正常组织，但均无统计学意义，P＞0.05。 (2)免疫组化免疫组化HME染色定位于肿瘤细胞、间质细胞、血管内皮细胞和神经细胞，胞浆着色。规定阳性细胞＜10％为阴性，10％～50％为阳性+，＞50％为阳性++。结果发现正常组织中阴性54例，阳性+有4例(6.9％)；癌旁组织中阴性49例，阳性+有4例(6.9％)；阳性++有5例(8.6％)；胃癌组织中阴性20例，阳性+有8例(13.8％)；阳性++有30例(51.8％)。三组间HME免疫组化检测结果差异有统计学意义，P＜0.001；两两比较发现胃癌组织与正常组织比较，差异有统计学意义，P＜0.01；胃癌组织与癌旁组织比较，差异有统计学意义，P＜0.01；癌旁组织与正常组织比较，差异无统计学意义，P＞0.05。 结论1.在胃癌细胞株MGC-803、SGC-7901、AGS中，无论在mRNA水平还是在蛋白质水平，HME均为阳性结果。说明HME在胃癌细胞中有较高的表达率，可应用于临床研究。 2.胃癌患者中胃癌组织HMEmRNA和蛋白表达最高，其次为癌旁组织和正常组织，说明HME可能是一项有潜在价值的肿瘤相关标志物。 3.HMEmRNA阳性患者淋巴结转移发生率小于阴性者(P＜0.05)，HMEmRNA阳性患者GST基因表达阳性率小于阴性者(P＜0.05)，HMEmRNA阳性患者两年生存率高于阴性者(P＜0.05)，表明HME表达阳性与胃癌转移潜能降低有关，可能是预后良好的标志。

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