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上皮性卵巢癌中FANCF基因表达缺陷及其启动子CpG岛过甲基化研究

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实验流程图

前言

第一部分上皮性卵巢癌中FANCF基因表达缺陷与其启动子区甲基化的关系

第二部分甲基转移酶抑制剂对卵巢癌细胞中FANCF基因表达影响及其对紫杉醇细胞毒性影响的研究

Research Paper Promoter Hypermethylation of FANCF Plays an Important Role in the Occurrence of Ovarian Cancer through Disrupting Fanconi Anemia-BRCA Pathway

综述卵巢癌紫杉醇耐药产生机理及逆转耐药策略

攻读博士学位期间完成的学术论文

致谢

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摘要

第一部分 上皮性卵巢癌中FANCF基因表达缺陷与其启动子区甲基化的关系 目的：研究上皮性卵巢癌中FANCF(FanconianemiacomplementationgroupF)基因表达变化，分析这种差异表达与该基因启动子区CpG(Cytosinephosphateguanosine)岛甲基化的关系。 方法：逆转录聚合酶链技术(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)检测7种卵巢癌细胞系、18例卵巢癌组织和10例正常卵巢组织中FANCF基因的表达；WesternBlot对FANCF蛋白进行定量检测，分析蛋白水平上的FANCF表达的变化，并与正常卵巢组织中的FANCF基因表达情况进行对比。同时用甲基化特异性的PCR技术(MethylationspecificPCR，MSP)对细胞系和组织中的FANCF基因DNA进行甲基化分析。 结果：大部分卵巢癌细胞系和组织中FANCFmRNA和蛋白的表达均显著下降，其中细胞系、卵巢癌组织和正常卵巢组织中FANCFmRNA表达分别为0.15±0.10、0.33±0.08、1.61±0.13，卵巢癌细胞系、卵巢癌组织分别与正常卵巢组织相比，统计学分析差异均有显著性(P＜0.01)。蛋白分析结果与mRNA结果相同。卵巢癌组织中41.7％(5/12)的FANCF基因表达下降的原因是FANCF基因启动子区域CpG岛甲基化。卵巢癌细胞系和组织中甲基化率分别为14.3％(1/7)和27.8％(5/18)。所有甲基化的细胞系和卵巢癌组织的FANCF表达均下降。甲基化更易于出现于年轻的患者[40％(4/10)，＜=48岁；12.5％(1/8)，＞48岁]。FANCF基因甲基化多出现于晚期卵巢癌患者，甲基化者均为ⅡC期以后的患者(2个ⅡC期，3个Ⅲ期)。 结论：FANCF基因表达缺陷在卵巢癌发生发展有重要的作用，甲基化可能是其表达缺陷的一种重要机制并与其预后关系密切，但甲基化并不是FANCF表达缺陷的唯一原因。 第二部分 甲基转移酶抑制剂对卵巢癌细胞中FANCF基因表达影响及其与紫杉醇相互作用的研究 目的：探讨甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，5-ADC)对FANCF甲基化的卵巢癌细胞系OVCAR3中FANCF基因表达的影响，观察5-杂氮-2'-脱氧胞苷对人卵巢癌细胞的FANCF基因表达的调节、对卵巢癌细胞增殖的影响及其对化疗药物紫杉醇敏感性的影响，探讨其抗肿瘤效应及可能的机理，寻找卵巢癌治疗的新靶点。 方法：采用甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理FANCF基因甲基化的卵巢癌细胞系OVCAR3后，用甲基化特异性PCR(MSP)分析FANCF基因甲基化状态，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FANCFmRNA的表达，FANCF蛋白表达采用WesternBlot检测，4-甲基偶氮唑蓝[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT]染色分析细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞处理前后对紫杉醇的敏感性差异。建立人卵巢癌OVCAR3细胞系裸鼠荷瘤模型，观察5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理前后的肿瘤的生长情况。用免疫组织化学技术检测裸鼠荷瘤中FANCF蛋白表达的变化。以FANCF非甲基化卵巢癌细胞系A2780裸鼠荷瘤模型作为对照。 结果：5-杂氮-2’-脱氧胞苷处理可以使卵巢癌细胞系OVCAR3中FANCF基因甲基化消失，基因表达增高。处理前后其mRNA表达分别为0.05±0.01与0.76±0.05。同时发现细胞增殖缓慢，细胞倍增时间延长了24h。体内试验也验证了肿瘤去甲基化后细胞增殖延缓的结果，用药组和对照组肿瘤体积分别为(0.24±0.02)cm3和(0.68±0.01)cm3，最终肿瘤重量分别为(0.0351±0.0037)g和(0.2762±0.0217)g，差异有极显著性(P＜0.01)，肿瘤组织免疫组化分析发现细胞用药组中FANCF蛋白表达增高。用药后细胞对化疗药物的敏感性下降，紫杉醇作用下凋亡率下降为(8.67±0.31)％，与对照组(23.25±1.44)％相比，差异有显著性(P＜0.05)。FANCF基因未甲基化的A2780细胞系在5-杂氮-2’-脱氧胞苷处理后仍然为非甲基化状态，基因表达也无明显改变，处理前后其mRNA表达分别为1.42±0.06与1.44±0.07，处理前后的裸鼠荷瘤模型中肿瘤体积和重量无差别表达，对化疗药物紫杉醇的敏感性无改变。 结论：甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷体内体外均能使OVCAR3细胞中因甲基化而失活的FANCF基因重新表达，抑制肿瘤细胞生长，为治疗卵巢癌提供了实验依据。但其增加了紫杉醇化疗耐药的风险，两者可能不宜合用。

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