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云南几种濒危野生兰花菌根真菌的筛选及菌根结构研究

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1研究背景

1.1兰科植物的研究概况

1.2兰科植物内生真菌的研究概况

1.2.1兰科植物内生真菌分类地位和专一性研究

1.2.2兰科植物内生真菌的作用

1.3兰科内生真菌对兰花组培苗作用的研究

1.4本研究的目的和意义

2地生兰组培快繁及栽培技术研究

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2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1种子繁育培养基配方试验

2.2.2茎尖培养基配方试验

2.3结论与讨论

图版

3云南几种地生兰内生菌根真菌的分离

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1分离试验结果

3.2.2性状观察与子实体诱导结果

3.3结论与讨论

图版及说明

4云南几种地生兰内生菌根真菌的筛选

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.3结论与讨论

图版

5春兰、墨兰、虎头兰、齿瓣石斛、铁皮石斛、玫瑰石斛、卡特兰的菌根显微结构观察

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5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果与分析

5.3结论与讨论

5.3.1侵入途径

5.3.2菌丝、菌丝结在根中的分布

5.3.3菌丝的活力

5.3.4针状结晶

5.3.5淀粉粒

图版及说明

6春兰、墨兰、虎头兰菌根的超微结构观察

6.1材料与方法

6.1.1材料

6.1.2方法

6.2结果与分析

6.2.1春兰菌根的超微结构

6.2.2墨兰菌根的超微结构研究

6.2.3虎头兰菌根的超微结构研究

6.3结论与讨论

图版及说明

参考文献

致谢

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摘要

本研究应用显微技术从地生兰与其菌根真菌的共生培养体系,研究地生兰与菌根真菌之间的相互作用。广义的兰花是整个兰科植物(Orchidaceae)的总称。从我国传统的“兰花”概念上说,中国兰花仅指产于我国的兰科、兰属(Cymbidium)植物,而且主要指其中的地生兰。地生兰是一类观赏价值和经济价值极高的花卉。云南是全国兰科植物分布最丰富的地区,但目前的开发与利用仍处于初级阶段,由于供需矛盾突出,在经济利益驱动下,农民上山大量采挖野生地生国兰,野生兰花资源受到严重破坏,为保护濒危兰花资源,需大量繁殖。繁殖方法多采用组培,但移栽无菌组培苗成活率低,生长缓慢,开花延迟,花小甚至不开花。成年兰花与真菌共生形成菌根是自然界的一种普遍现象,菌根真菌为兰科植物提供生长所必需的营养物质。因此,组培苗菌根化是促进地生兰快速繁殖的重要技术,也是解决濒危兰花资源人工栽培的关键。 为探讨菌根真菌与兰科植物间的相互作用机制,在盆栽和纯培养条件下,用分离获得的真菌菌株分别接种春兰(Cymbidiumgoeringii(Rchb.f.)Rchb.f.)、虎头兰(C.hookerianum)及齿瓣石斛(Dendrobiumdevonianum)。通过组培苗人工接种菌根技术筛选出与兰花有效共生并能明显促进兰苗生长的优良菌株。从生物量增长、显微和超显微结构、重分离接种菌株等方面获得的证据表明,己成功建立了春兰等种子繁育组培幼苗和丝核菌共培养体系;用超薄切片技术及电子显微镜,对兰花营养根消化菌根真菌过程和细胞超微结构的变化进行了研究,探索利用兰科内生菌根真菌促进地生兰种子繁育组培幼苗生长发育的方法,为解决兰科珍贵花卉人工栽培提供理论依据。研究结果表明: 1.春兰、虎头兰和齿瓣石斛的种子在人工培养基上均可诱导发芽并最终形成试管苗,三种种子培养基配方中添加适量的椰乳及购置专门的兰花营养液等,给种子提供了多种必需的营养生长物质和环境条件,有利于种子的正常生长和发育;此外种子的成熟度与在培养基上的萌发时间的长短密切相关,成熟度越高,萌发时间越短,种子苗成活率越高;另还与抑制褐变的活性碳及维生素C有关。 春兰的茎尖组织培养研究筛选出有利于原球茎诱导增殖的培养基为1/2MS+NAAO.5mg/L+6-BA3.0mg/L;有利于不定芽的分化的培养基1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L,有利于不定芽的增殖的培养基1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L,增殖率为4;有利于生根的培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L。 2.从云南省兰科植物的主要产区的8个地区12品种89株兰科植物的营养根上共分离获得真菌菌株185个,其中出现频率较高或者文献曾报道为兰科内生菌根真菌的有64个代表菌株,根据菌落形态、菌丝特征、产孢结构、孢子形态及子实体诱导等大致分为18类,它们分别隶属于丝核菌属(Rhizoctonia)、兰科丝核菌类(Orchidaceousrhizoctonias)、毛壳菌属(Chaetomium)、木霉属(Trichoderma)、镰刀菌属(Fusarium)、Diplococcoium、枝顶孢属(Acremonium)、异孢迭球孢霉(Sarcinella)、团丝核菌属(Papulaspora)、Trichosporiella、Gliomastixmurorum、小菇属(Mycena)、微囊菌属、Catenulariapiceae、丝孢纲(Hyphomycetes)的其它属等。 3.通过接种、生物量测定、重分离、显微及超微观察连续切片等,筛选出CLB211、CLB213和KW214三菌株为春兰、虎头兰和齿瓣石斛的优良菌根真菌。分离自云南保山野生春兰的CLB211、CLB213和分离自卡特兰的KW214三个丝核菌菌株接种春兰、虎头兰等组培幼苗上经4.5个月的共生培养,兰苗叶色正常、根系生长良好、对幼苗生长有不同程度的促进作用,处理春兰苗的鲜重增长率(%)分别为70.6、70.2、66.1,而不接菌对照仅为45.6,CLB211、CLB213的菌株处理春兰苗与对照达极显著差异(α=0.01),KW214菌株处理春兰苗与对照达显著差异(α=0.05)。接种MLX103(分离自西双版纳野生墨兰)、CLN115(分离自怒江贡山野生春兰)菌株后对虎头兰及齿瓣石斛幼苗均有明显的促进作用。春兰、虎头兰、齿瓣石斛等组培苗接种能与其共生并形成菌根的优良菌根真菌后可明显促进兰苗的生长,并由此认为不同种类的兰花在同一地区可以具有相同的菌根真菌,同一种兰花在不同的地区可以具有不同的菌根真菌,再一次证明兰花菌根真菌的专一性不是很强的。 4.应用光学显微镜和电子显微镜连续观察春兰、墨兰、虎头兰、齿瓣石斛、玫瑰石斛、卡特兰等的菌根结构,真菌先通过根被组织,在具有通道细胞的兰根中,真菌菌丝自外皮层薄壁通道细胞侵入皮层细胞,如春兰、虎头兰、齿瓣石斛、铁皮石斛、玫瑰石斛、卡特兰;而在无通道细胞的兰根中,则是通过破坏根被组织和外皮层细胞来侵入皮层细胞,如墨兰。进入皮层组织细胞,并通过菌丝穿越细胞壁不断向内延续扩展,光学显微镜下观察到的在皮层细胞内形成大量着色较深形状不规则的菌丝团(Pelotons)。在电子显微镜下观察是围绕细胞核的真菌菌丝,菌丝团在皮层组织靠外的几层细胞中出现较多,随着菌丝团被逐渐消解吸收,伴随新菌丝生长和入侵,内生真菌可不断为兰花提供营养,促进兰花快速生长。

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