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洋葱假单胞菌G63脂肪酶产酶条件优化及同源高效表达

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从武汉、襄樊和长沙等地采集含油污土样90份，经平板粗筛、摇瓶复筛，得到酶活力在5.0U/mL以上菌株4株，其中洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）G63酶活最高，达到15.5U/mL。 应用单因子试验（Monofactorial Experiment）和正交实验（Orthogonal test）对Pseudomonas cepacia G63产脂肪酶发酵条件进行了快速优化。首先应用单因子试验确定Pseudomonas cepacia G63产脂肪酶最适碳源和最适氮源分别为：葡萄糖和酵母提取物。在此基础上通过考察3个因数（A：葡萄糖，B：酵母提取物，C：橄榄油）, 每个因素均取3个水平, 选用正交表L9 (34) 进行试验。得到较为合适的培养基组成。最后通过单因子试验确定最适发酵温度和最适起始pH。得到优化培养条件为：酵母提取物2％，葡萄糖 0.5％，K2HPO4 0.3％, MgSO4 0.05％，起始pH7.5,在28℃培养60h后，酶活达到45.23U/mL。与初始相比，酶活提高了2.66倍。 在此基础上研究了Pseudomonas cepacia G63脂肪酶的酶学性质。酶的最适pH和温度分别为9.0和70℃，在pH5.0～9.5和70℃以下稳定。同时酶对检测的各短链醇有着非常好的稳定性。 随后本研究运用PCR的方法从高产脂肪酶的洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）G63克隆了脂肪酶基因及其伴侣基因。该脂肪酶基因开放式阅读框（ORF）为1092bps，编码364个氨基酸残基。经KpnI/HindIII酶切，将其克隆到广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上，构建成质粒pBBR-LipAB。通过三亲杂交，在辅助质粒pRK2013的帮助下，使该基因在原始菌株中高效表达。所构建的工程菌较原始菌株酶活提高3.6倍。

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