轮状病毒抗原免疫学检测方法及针对其三种主要抗原IgG抗体的保护作用

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本研究通过分别制备针对RV VP6、VP7和NSP4蛋白的IgG抗体，被动免疫小鼠后，观察这些IgG抗体的保护作用，从而为进一步阐明轮状病毒的免疫保护机制、发现疫苗效力可靠评价指标提供线索。另外，RV的预防控制将是公共卫生工作的长期任务，这一工作的开展离不开快速、准确的RV实验室诊断技术。本研究利用单克隆抗体技术制备了针对RV VP6蛋白的单克隆抗体(McAb)，并在此基础上建立了RV检测用双抗体夹心ELISA方法。 1 抗轮状病毒VP6单克隆抗体的制备及轮状病毒双抗体夹心ELISA方法的建立为了建立一种快速、有效地制备单克隆抗体的方法，本研究使用表达轮状病毒VP6的重组腺病毒rvAdVP6(opt)作为免疫原，经鼻腔免疫BALB/c小鼠3次、经脾内注射加强免疫一次后，取得了良好的免疫效果，小鼠血清抗体滴度在8w内达到(2.4±0.43)×10<'5>。取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合之后，成功筛选到分泌高滴度特异性单克隆抗体的2个杂交瘤细胞克隆1-5A7和4-3E3。经ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和Westem Blot等验证，这两株McAb均特异性识别RV VP6三聚体形式的构象依赖性表位，但识别的抗原表位不同。在此基础上，以1-5A7作为捕获抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记的4-3E3为检测抗体，建立了基于抗VP6单克隆抗体的检测轮状病毒的夹心ELISA方法。应用本方法对临床婴幼儿无菌性腹泻标本样品中的RV进行了测定，测定结果与传统RT-PCR方法进行了比较，二者在统计学上不存在差异(X<'2>=1.55，p>0.05)。以轮状病毒的RLT-PCR检测方法为标准，检测双抗体夹心ELISA的特异度和灵敏度分别为73.3％和95.8％，二者的符合度为87.1％。本研究获得的McAb不仅可用于轮状病毒的常规ELIsA检测，也为未来腹泻病毒病原高通量检测的蛋白芯片等技术开发打下了基础。 2 抗轮状病毒VP6、VP7和NSP4 IgG抗体对小鼠免疫保护作用的研究为了制备抗RV NSP4的IgG抗体，首先分别在腺病毒和杆状病毒载体中对NSP4进行了表达。为了提高NSP4的表达量，在不改变氨基酸序列的前提下，根据人类细胞的密码子偏性，人工优化合成了RV的全长NSP4基因。分别将密码子优化过的和野生型NSP4基因插入腺病毒载体系统的穿梭质粒pp2和杆状病毒表达载体pFastBacl，通过细菌内同源重组和细胞转染得到了表达野生型NSP4基因的重组腺病毒rvAdNSP4(ori)和表达野生型与密码子优化NSP4基因的重组杆状病毒rvBacNSP4(ori)和rvBacNSP4(opt)。Westem blot试验证实这些重组病毒可有效表达NSP4基因。在此基础上，分别使用表达RV VP6、G3型VP7和NSP4蛋白的重组腺病毒rvAdVP6(opt)、rvAdG3VP7(opt)和rvAdNSP4(ori)经鼻腔免疫雌性BALB/c小鼠4次，收获血清后利用Protein G柱亲和纯化血清中的IgG抗体。分别将纯化的IgG抗体按高(VP6抗体滴度30000，VP7抗体滴度16000)、低(VP6抗体滴度3000，VP7抗体滴度8000，NSP4抗体滴度2000)两种剂量经尾静脉注射被动免疫BALB/c小鼠。被动免疫1d后高剂量组的VP6抗体和G3VP7抗体在血清中的滴度分别达到了4000±0.00和2400±894.43，低剂量组的VP6抗体和G3VP7抗体分别达到了1100±547.72和180±44.72，而NSP4低剂量组的小鼠体内只检测到<25的抗体滴度，实验组粪便样本中未检测到黏膜局部IgG抗体和IgA抗体的升高。被动免疫1d后，用10DD<,50>的鼠RV EDIM株攻击受试小鼠，连续收集攻毒后1～8d和第14d的粪便样本，检测小鼠的排毒情况。结果显示，实验组的小鼠虽然血清中有特异性的IgG抗体存在，但是不足以保护其免受RV的感染，与对照组相比没有统计学差异，提示在目前免疫水平，抗RV VP6、VP7和NSP4 IgG抗体均不能对小鼠提供保护作用。综上所述，本研究通过抗RV VP6构象依赖型表位的单克隆抗体建立了检测RV抗原的双抗体夹心ELISA方法，首次通过抗RV三种主要抗原VP6、VP7和NSP4的血清IgG被动免疫初步评估了其保护作用，这些结果的取得为发展轮状病毒新型检测技术和阐明其免疫保护机制提供了基础。

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作者
束弋;
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作者单位

中国疾病预防控制中心;

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授予单位中国疾病预防控制中心;
学科免疫学
授予学位硕士
导师姓名洪涛,王健伟;
年度 2007
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类医学免疫学;免疫学检验;
关键词
轮状病毒; 单克隆抗体; 抗原免疫学检测; 免疫保护;

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