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肝细胞与睾丸支持细胞共微囊化移植治疗大鼠急性肝衰竭及Cyclin D1在肝组织中的变化

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综述 肝细胞混合共微囊化的研究

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摘要

目的：体外观察大鼠睾丸支持细胞(Sertolicell)对肝细胞的营养支持作用，并观察Sertoli细胞对微囊化肝细胞腹腔移植治疗大鼠急性肝衰竭(AHF)的疗效影响，通过研究AHF及各治疗组肝组织中CyclinDl的动态变化了解肝再生情况。同时，结合体外淋巴细胞增殖抑制试验和移植后腹水淋巴细胞计数及微囊情况，了解Sertoli细胞的免疫豁免(immuneprivilege)功能。 方法： 1.原代细胞分离及微囊的制备：Seglen原位二步胰酶灌注法对大鼠肝脏进行肝细胞分离及纯化。胶原酶-胰酶二步消化法提取Sertoli细胞。从脾脏以淋巴细胞分离液提取脾淋巴细胞。将肝细胞或与Sertoli细胞混合后，与2.0％海藻酸钠混匀，于自制微囊发生仪下制备各种细胞微囊。 2.不同比例Sertoli细胞与肝细胞混合微囊化体外培养：将肝细胞与Sertoli细胞以100:1、50:1、20:1、10:1等不同细胞数比例混合体外培养，另设一组纯肝细胞微囊培养，选取12h和24h及3、5、7、14和21d时间点检测培养上清白蛋白与尿素含量，并观察肝细胞形态。 3.脾淋巴细胞增殖抑制试验：按试验要求分组：对照组：裸肝细胞组；裸支持细胞组；空微囊组；肝细胞微囊组；支持细胞微囊组；混合共微囊组。培养1d后，各组均加入1×105个/孔的脾细胞。于培养72h后，以CCK-8比色法测定脾细胞数量。 4.AHF模型制备及分组：腹腔注射10％D-氨基半乳糖(D-GalN)溶液至雄性成年SD大鼠，正常对照组注射同等体积的生理盐水。将AHF模型大鼠在造模后随机分成4组：模型组；裸肝细胞移植组；微囊化肝细胞移植组：混合微囊化组。 5.指标检测：分别在造模后6h、12h、24h、48h、72h、120h、168h动态观察血清肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)的变化。肝组织用免疫组织化学方法(SABC法)检测CyclinDl蛋白的表达，半定量RT-PCR法检测CyclinDlmRNA的表达。另设正常对照组大鼠8只。 6.微囊化肝细胞移植组与混合微囊化组大鼠腹腔内微囊的观察及腹水淋巴细胞的计数：观察腹腔内微囊的位置情况，并镜下观察其形态变化。同时留取滤除微囊后的腹水于全自动尿液分析仪测定淋巴细胞数。 结果： 1.大鼠肝脏分离所得肝细胞经0.4％台盼蓝染色判断细胞产量为5×107以上，活率大于90％。睾丸分离Sertoli细胞纯度达90％以上，体外培养生命力强，生长旺盛。脾淋巴细胞细胞活性＞95％，体外培养不贴壁，存活达5d。自制装置下制备细胞微囊，微囊直径在400μm-800μm之间，囊内84％以上细胞成活。 2.体外肝细胞功能测定：肝细胞与Sertoli细胞以20:1及10:1比例混合微囊化组与其他各组相比，培养液中自蛋白分泌和尿素合成量随时间变化而明显增加(均P＜0.05)，并在5d达高峰(其他组在3d)，于3～7d一直维持在高位，下降趋势缓慢。20:1及10:1两组间白蛋白和尿素含量均无显著性差异。 3.脾淋巴细胞增殖抑制试验：各孔用CCK-8比色法测定A450值，发现肝细胞微囊组较裸肝细胞组下降(P＜0.05)，而与混合微囊组相比，后者则使脾细胞的增殖受到进一步抑制(P＜0.05)。 4.AHF模型建立后24h，大鼠表现极度虚弱、精神萎靡、嗜睡，部分出现抽搐现象；血ALT、AST和TBil升高；肝病理学表现为肝细胞坏死广泛而严重，肝索解离，小叶结构模糊不清，肝窦扩张并出血，小叶内及汇管区有淋巴细胞和巨噬细胞浸润，残存肝细胞水肿变性，表明AHF动物模型成功建立。 5.AHF模型建立后ALT、AST、TBil迅速升高(与正常组相比，P＜0.05)，模型组和裸肝组ALT、AST均在48h达高峰，微囊化肝细胞组和混合微囊组无波峰形成，各组随后均呈下降趋势，以混合共微囊组为著(P＜0.05)。TBiL在模型组于72h达高峰，其他组均在48h后即呈下降趋势，以共微囊组波动最平缓。 6.各组肝组织CyclinDl免疫组化情况：正常大鼠肝组织无或极微量CyclinDl阳性表达(与其它组比较，均P＜0.05)；其余各组均有明显CyclinDl阳性表达，以中央静脉周围和汇管区及坏死区周围表达最为明显。各组内CyclinDl阳性细胞计数呈一定规律性变化，均在第72h达高峰，以后逐渐下降。混合微囊组CyclinDl阳性细胞计数在72h、120h、168h均较其他各组高(P＜0.05)。 7.AHF大鼠肝组织中CyclinDlmRNA的表达较正常组明显增加(P＜0.05)，造模后各组CyclinDlmRNA表达在48h最高，混合微囊组较其他组在72h、120h、168h时间点比较有显著差异(P＜0.05)。 8.大鼠腹腔内微囊的观察：腹腔内微囊多集聚于大网膜及肠系膜之间，未见粘连情况。镜下观察发现，微囊有不同程度的变形，部分微囊可见少量的松散纤维包裹。各组的微囊形态学改变表现雷同。 9.微囊化肝细胞组与混合微囊组大鼠腹水淋巴细胞计数：两组微囊均引起腹水淋巴细胞增多，但造模48h后微囊化肝细胞组明显较后者升高为著(P＜0.05)。 结论： 1.原代肝细胞、Sertoli细胞及脾淋巴细胞分离及纯化方法先进，所得细胞产量及活率符合实验要求。微囊制备技术可行性高，但仍需进一步提高微囊的稳定性和均一性。 2.体外培养发现，Sertoli细胞可增强肝细胞的功能并延长生存时间。同时发现，肝细胞与Sertoli细胞20:1混合时已能显著提高肝细胞功能。 3.AHF模型造模成功，大鼠状态、肝脏组织学及生化学改变符合AHF表现。 4.肝细胞移植(Hepatocytetransplantation，HCT)能降低AHF大鼠ALT、AST和TBil水平，减轻肝损伤程度。混合微囊化移植对AHF大鼠的疗效优于纯肝细胞微囊移植。 5.肝组织CyclinDl蛋白与mRNA在AHF初期表达均呈加强趋势，但随肝衰加重而渐减弱。HCT可提高CyclinDl的表达，特别是混合微囊移植，可能通过抑制肝细胞凋亡和促进肝细胞再生而发挥保护作用。动态观察CyclinDl蛋白及mRNA的表达，有利于判断AHF肝细胞的再生情况及预后的判断。 6.Sertoli细胞与肝细胞混合共微囊化可减少腹腔移植腹水淋巴细胞的聚集，结合淋巴细胞增殖抑制试验，说明混合微囊化的Sertoli细胞仍有抑制淋巴细胞的功能，从而减少淋巴细胞聚集而达到免疫豁免的可能。腹腔内微囊形态学的改变，说明微囊的稳定性仍欠缺，提示需进一步改进制作方法及材料。

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