E血清型沙眼衣原体主要外膜蛋白B细胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究

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目的： 1.预测E血清型沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MajorOuterMembraneProtein,MOMP)B细胞表位，可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。 2.构建含预测B细胞表位基因的原核重组质粒pET32a(+)/CtMOMPP1P2、pET32a(+)/CtMOMPP5P6和pET32a(+)/CtMOMPP7P8并使之在原核表达系统中表达并纯化，获得P1P2、P5P6、P7P8表位融合蛋白，以进一步鉴定其抗原特性。 3.P1P2、P5P6、P7P8融合蛋白免疫小鼠，通过ELISA方法检测诱导的鼠血清特异性抗体，及其与Ct全菌体的结合能力。为Ct相关疾病的疫苗设计及研制相关诊断试剂奠定基础。方法： 1.以E型Ct标准株MOMP的完整氨基酸序列为基础，采用GOR、Hopp-Woods的亲水性方案、Emini表面可及性方案、Jameson-Wolf抗原指数方案和Janin可及性方案，辅以对MOMP蛋白的二级结构中的柔性区域及跨膜区域的分析，预测CtMOMP蛋白的B细胞表位。 2.选取预测的B细胞表位基因序列，按原核系统偏爱的氨基酸密码子优化，委托生物技术公司合成寡核苷酸，退火获得目的基因，并将目的基因克隆至原核表达载体pET32a(+)多克隆位点内。将此重组载体转化E.coliBL21(DE3)表达融合蛋白，并经SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白P1P2、P5P6、P7P8及His蛋白。 3.用纯化的蛋白P1P2、P5P6、P7P8作为免疫原，分别于第0w、2w和4w免疫ICR小鼠(9R/组)，并以His蛋白和PBS作为阴性对照和空白对照组。于第0w、1w、3w、5w和17w，每组取小鼠尾静脉血，制备免疫血清抗体。采用间接ELISA方法检测P1P2、P5P6、P7P8蛋白的免疫原性和抗体效价，及其与Ct全菌体的结合情况。结果： 1.CtMOMP二级结构的预测均表明，最有可能的B细胞表位位于MOMP蛋白N端第73～81区段、第161～175区段、第217～225、第261～270区段和第377～386区段内或它们的附近。 2.酶切鉴定和核苷酸测序表明，成功构建了3个编码B细胞表位的原核表达质粒。SDS-PAGE分析表明，在37℃1.0mMIPTG作用下诱导6h均能很好地表达目的蛋白，相对分子质量(Mr)约为21～22kDa，与预期Mr大小吻合；蛋白表达量均约占细菌总蛋白量的40％。WesternBlot结果显示单一明显条带，与SDS-PACE中位置吻合。用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化得到表位融合蛋白，纯度均达95％以上。 3.3种表位融合蛋白免疫ICR小鼠均可获得高效价的免疫血清。经间接ELISA方法检测：表位融合蛋白均能刺激机体产生抗体；抗体效价随免疫次数增加而升高；融合蛋白P5P6(CtMOMP377～386)、P7P8(CtMOMP261～270)鼠免疫血清中含有Ct全菌体的特异性抗体，与对照组有显著性差异；P1P2(CtMOMP73～81)免疫血清中的抗Ct全菌体特异性抗体与对照组无明显差异。结论： 1.预测并筛选了5个可能的CtMOMPB细胞表位。 2.通过分子克隆分别成功构建了3个含B细胞表位的重组质粒pET32a(+)/CtMOMPP1P2、pET32a(+)/CtMOMPP5P6和pET32a(+)/CtMOMPP7P8；在原核表达系统内分别高效表达了表位融合蛋白P1P2、P5P6、P7P8；通过亲和层析法得到了纯化的表位融合蛋白。 3.表位融合蛋白免疫ICR小鼠血清学检测，表明预测的3个B细胞表位融合蛋白均能刺激机体产生抗体，其具有较强的免疫原性，抗体效价随免疫次数增加而升高；表位融合蛋白P5P6、P7P8诱导所产生的抗体含有高滴度的抗D型、E型Ct全菌体的特异性抗体。本实验为Ct相关疾病基因工程疫苗的设计和研制，以及实验诊断技术的发展提供了理论基础和实验依据。

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作者
陈军;
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作者单位

温州医科大学;

温州医学院;

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授予单位温州医科大学;温州医学院;
学科病原生物学(性传播疾病病原学研究)
授予学位硕士
导师姓名张丽芳,姜丽萍;
年度 2008
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R374.1;
关键词
E血清型沙眼; 衣原体; 外膜蛋白; 单克隆抗体; 疫苗设计;

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