一、血清miRNAs用于乳腺癌早期诊断中的表达谱分析；二、ZEB1与乳腺癌化疗耐药的靶基因研究

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第一部分血清miRNAs用于乳腺癌早期诊断中　　目的：乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居中西方女性罹患癌症之首，也使该病成为医学界的一项难题。随着女性对乳腺健康的重视度逐渐提高，对于乳腺癌的早诊早治也是攻克乳腺癌迫切需要解决的问题。传统的诊断指标普遍敏感性和特异性低，另外还有超声、钼靶、MRI等，均不能同时保证无创、易取且稳定的优点。　　miRNA是一种广泛存在于真核生物体内的短小非编码RNA，长度约21-23nt，可以通过与mRNA序列互补阻遏蛋白翻译，从而调控蛋白表达进而影响生物学功能。由于具有稳定不易降解、易获取等优点，血清miRNA表达谱作为生物标志物用于多种肿瘤及重大疾病的诊断也成为了近年来分子诊断的热门研究之一。本文利用乳腺癌患者血清，针对不同分组间血清miRNA的差异表达，分析了血清miRNA作为分子标志物在临床诊断上的应用以及miR-455-3p靶向PIK3CA基因在乳腺癌的发生发展中的作用。　　方法：我们共收集了92个乳腺癌患者，100个乳腺纤维腺瘤和100个健康人，又进一步将乳腺癌样本按照淋巴结转移组、淋巴结无转移组、原位癌和浸润癌两种方法进行分组后进行混合，接着对各组样本进行Affymetrix miRNA芯片筛选，再将每组结果一一进行合并选出差异表达的miRNA，再用荧光定量PCR(qRT-PCR)按初筛和复筛两步验证芯片结果。接着我们通过TargetScan和mirBD等网站上进行miR-455-3p靶基因的预测分析，发现miR-455-3p可以靶向PIK3CA的3’UTR，遂利用收集的乳腺癌标本提取蛋白和总RNA，通过WB、Real-time PCR和双荧光素酶报告等实验检测miR-455-3p与PIK3CA表达水平的相关性以及在PI3K/Akt/mTOR通路的作用。　　结果:通过Affymetrix miRNA芯片筛选出11个miRNA作为候选分子，经过初筛和复筛过程，由于miR-455-3p在原位癌和淋巴结无转移组样本中高表达，而miR-1825和miR-1915-3p在浸润癌和淋巴结转移组样本中高表达，结果具有统计学意义。其中miR-455-3p的特异度和灵敏度最好，被认为是乳腺癌早诊的血清标志物，而 miR-1825和miR-1915-3p作为转移的血清标志物。我们进一步检测miR-455-3p的功能发现，miR-455-3p可以抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移，并具有促凋亡的趋势。通过网站预测我们发现，miR-455-3p可以靶向PIK3CA的3’UTR，相关性较好，通过WB、Real-time PCR和双荧光素酶报告等实验印证了miR-455-3p可抑制PIK3CA减少肿瘤细胞的增殖和迁移能力，下调Akt的表达。　　结论：综上所述，我们的研究表明，miR-455-3p可作为乳腺癌早诊的血清标志物，而miR-1825和miR-1915-3p可作为转移的血清标志物。此外，miR-455-3p通过靶向PIK3CA基因，抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭等功能，在乳腺癌中发挥抑癌作用。另外，miR-455-3p虽然在乳腺癌中表达比健康人低，但在原位癌中表达比浸润癌较高，因为原位癌具有一定的恶变率，所以当miR-455-3p用于健康人筛查出现降低时，需要结合MRI等其他手段，动态观察病情变化。　　第二部分 ZEB1与乳腺癌化疗耐药的靶基因研究　　目的：随着社会的发展以及人类生活习惯的改变，乳腺癌的发生率也呈现了逐年增加的趋势，目前已成为中西方女性发病率位居第一位的恶性肿瘤。除手术之外，化疗也是乳腺癌的治疗方式的重要一环，其中乳腺癌常用的蒽环类药物主要是通过DNA损伤，造成肿瘤细胞的DNA信息无法继续传递而死亡。随着早期诊疗技术的不断提高，乳腺癌患者的预后已经得到了明显的改善，但是仍有15-20％的乳腺癌患者因为对化疗出现耐药而发生远处转移或复发，最终导致死亡。因此，深入揭开乳腺癌化疗耐药的分子机制才是改善乳腺癌患者预后的关键。转录调控因子ZEB1可作为上皮间质转化的关键分子，在维持肿瘤干细胞的干性，以及肿瘤的转移和侵袭等过程中都发挥了重要的作用。但在化疗耐药方面，ZEB1的作用尚不明确。因此本实验旨在利用ChIP、WB、Real-time PCR等实验验证了ZEB1在乳腺癌中如何参与DNA损伤和修复来造成乳腺癌化疗耐药的。　　方法：在本实验中，我们首先通过WB实验在不同分子分型的乳腺癌细胞系中检测ZEB1的表达。随后我们分别构建了过表达以及沉默ZEB1的两株细胞系并加入化疗药物刺激，通过细胞免疫荧光等方法检测了DNA损伤标志物γH2AX的表达。接着，我们又在大量临床标本中用免疫组化的方法检测了ZEB1、抗细胞凋亡因子Bcl-xl及细胞周期因子Cyclin D1的表达。最后，为了继续探索ZEB1与下游哪些靶基因相互作用造成化疗抵抗，我们通过ChIP、蛋白印迹法以及生物信息学等方法，在测序中查找到147个基因，并通过查阅文献最终筛选到9个ZEB1结合的候选基因，　　结果：通过实验我们发现ZEB1的表达与肿瘤细胞分子分型有关，在恶性预后的Basal型细胞系MDA-MB-231和SUM-159中呈高表达，而在预后较好的Luminal型细胞系MCF-7中呈低表达。随后根据细胞免疫荧光和免疫组化的结果发现ZEB1在恶性乳腺癌细胞中高表达可能与DNA损伤有关。并且ZEB1与化疗耐药相关的因子表达呈正相关，说明ZEB1与乳腺癌化疗耐药具有潜在的相关性，化疗耐药的原因是DNA损伤。通过ChIP、生物信息学分析和查阅文献，我们最终发现ATM既与ZEB1关系密切又与DNA损伤有关，有望为化疗耐药的机理研究翻开了新的篇章。

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作者
刘岑鸟;
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作者单位

重庆医科大学;

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授予单位重庆医科大学;
学科肿瘤学
授予学位博士
导师姓名向荣,任国胜;
年度 2016
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正文语种 chi
中图分类
关键词
乳腺癌,血清标志物,化疗耐药,早期诊断;

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