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农药百菌清胁迫下土壤微生物反硝化及N2O释放机制研究

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1 绪 论

1.1 研究背景

1.2 典型农药百菌清的概述

1.2.1 百菌清的使用情况及特性

1.2.2 百菌清在土壤环境中的耗散行为

1.2.3 百菌清对土壤中微生物的影响

1.2.4 百菌清对土壤氮循环的影响

1.3 土壤反硝化微生物代谢与反硝化机制概述

1.3.1 土壤反硝化微生物代谢过程

1.3.2 土壤微生物反硝化机制

1.3.3 土壤细菌真菌反硝化及N2O释放概述

1.4 分子生物学技术在环境领域的应用

1.4.1 高通量测序

1.4.2 基于测序的宏基因组学技术

1.5 研究目的、意义与内容

1.5.1 研究目的与意义

1.5.2 研究内容

1.5.3 技术路线

2 材料与方法

2.1 土壤样品的采集、处理与保存

2.2 试验的准备，设计与开展

2.2.1 试验药品

2.2.2 试验设计

2.2.3 检测仪器与设备

2.3 测试指标及方法

2.3.1 百菌清及4羟基百菌清测试方法

2.3.2 NO-3-N，NO-2-N，NH4+-N，CO2和N2O测试方法

2.3.3 呼吸速率和反硝化速率测试方法

2.3.4 关键酶活性测试方法

2.3.5 电子转移系统活性，NADH，ATP和丙酮酸测试方法

2.3.6 DNA提取，16S微生物测序和宏基因测试分析方法

2.4 统计分析

3 百菌清的累积及对土壤微生物活性的影响研究

3.1 百菌清的累积与耗散

3.1.1 短期曝露试验下百菌清在土壤中的残留与耗散特征

3.1.2 长期重复曝露试验下百菌清在土壤中的残留与耗散特征

3.2 4羟基百菌清在短/长期曝露试验中的产生

3.3 百菌清对土壤微生物活性的影响

3.3.1 百菌清对土壤微生物活性及群落结构的短期影响

3.3.2 百菌清对土壤微生物活性及群落结构的长期影响

3.3.3 4羟基百菌清对土壤微生物活性的影响

3.4 本章小结

4 百菌清对土壤微生物反硝化过程的影响研究

4.1 短期曝露下百菌清对土壤反硝化的影响

4.1.1 土壤NO-3-N，NO-2-N和NH+4-N

4.1.2 土壤反硝化速率及非竞争抑制模型

4.1.3 土壤反硝化酶活性，功能基因及微生物群落

4.2 长期曝露下百菌清对土壤反硝化的影响

4.2.1 土壤NO-3-N，NO-2-N和NH+4-N

4.2.2 土壤反硝化速率及酶活性

4.3 4羟基百菌清对土壤反硝化的影响

4.3.1 土壤NO-3-N和NO-2-N

4.3.2 反硝化酶活性和金属辅酶因子

4.4 宏基因组学揭示百菌清对土壤氮循环的影响

4.5 本章小结

5 百菌清对土壤细菌和真菌N2O释放的影响研究

5.1 短期和长期曝露下百菌清对土壤N2O释放的影响

5.1.1 短期试验下的影响

5.1.2 长期试验下的影响

5.2 细菌真菌反硝化抑制剂的选择

5.3 百菌清对土壤细菌和真菌反硝化N2O释放的影响

5.3.1 短期试验下的影响

5.3.2 长期试验下的影响

5.4 本章小结

6 百菌清干预土壤反硝化及N2O释放的分子机制研究

6.1 短期和长期曝露下百菌清对微生物代谢的影响

6.1.1 百菌清对碳源利用的影响

6.1.2 百菌清对微生物代谢过程中关键酶活性的影响

6.1.3 百菌清对微生物代谢过程中关键能源物质的影响

6.1.4 百菌清对反硝化过程中电子传递的影响

6.2 宏基因揭示百菌清对微生物代谢的影响

6.3 土壤反硝化过程与微生物代谢之间的关系

6.3.1 反硝化速率与酶活性和微生物代谢之间的相关关系

6.3.2 路径分析揭示百菌清影响土壤反硝化的关键因子

6.4 本章小结

7 结论与建议

7.1 结论

7.2 创新点

① 阐明了农药百菌清干预土壤反硝化的分子机理

② 揭示了百菌清影响细菌和真反硝化过程N2O释放的特征及途径

③ 建立了宏观过程与微观机理之间的耦合预测模型

7.3 建议

参考文献

附录

A. 作者在攻读博士学位期间发表的论文目录

B. 作者在攻读博士学位期间参加的主要科研项目

C. 作者在攻读博士学位期间参加的主要学术会议

D. 学位论文数据集

致谢

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摘要

农药百菌清是一种高效、广谱杀菌剂，被广泛应用在农业生产活动中，保障粮食安全。由于其频繁使用，百菌清最终会累积在土壤环境中，潜在影响了土壤微生物活性及其主导的元素循环过程。土壤微生物催化完成的反硝化过程是土壤氮循环的关键步骤，不仅会导致土壤生物可利用氮素损失，还会造成强温室气体氧化亚氮（N2O）释放。因此，土壤反硝化一直是国内外的研究热点。百菌清及其代谢产物的残留潜在地威胁了土壤微生物活性，干预微生物反硝化过程。目前，国内外关于农药对土壤微生物反硝化及其N2O释放的机理研究相对较少。因此，本研究从分子生物学和 15N同位素示踪层面，深入调查了百菌清及其最主要代谢产物 4 羟基百菌清对土壤微生物活性的影响，探明了百菌清干预土壤反硝化过程的机理，辨析了百菌清对细菌和真菌反硝化N2O释放的影响规律及各自贡献，建立了宏观速率与微观代谢之间的耦合关系，识别了预测土壤反硝化过程的关键因子，主要结论如下：　　（1）短期试验内（72 h），5 mgkg-1试验组中的百菌清耗散率为24.8 %，显著高于10和25mgkg-1试验组中的耗散率（10.3 %和4.6 %）。这表明5 mgkg-1试验组中有明显的百菌清降解行为，而在10和25 mg kg-1试验组中，可能由于高浓度的百菌清对土壤中微生物产生毒性，导致了较低的耗散率。此外，只有5 mgkg-1试验组检测到0.41 mg kg-1降解产 物4羟基百菌清，而10和25 mg kg-1试验组均未检测出。长期试验内（40 d），5和10 mg kg-1试验组中百菌清耗散率分别为51.1%~59.7%和22.3% ~40.6%，显著高于25mgkg-1试验组（11.8% ~15.6%）。周期结束后，残留在5、10和25 mg kg-1试验组中的百菌清含量分别为11.23±0.27 mg kg-1、36.07±0.28 mg kg-1和110.25±1.62 mg kg-1。三组均检测出4羟基百菌清，浓度维持在0.07 mg kg-1~2.18 mg kg-1。　　（2）本研究利用土壤呼吸速率来揭示百菌清对土壤健康及微生物活性的影响。结果表明百菌清，而非 4 羟基百菌清显著影响土壤健康和微生物活性。无论长期还是短期试验，百菌清均显著降低了土壤本底呼吸速率（16.74%~57.66 %）和基质诱导呼吸速率（27.68 %~58.58 %）。这表明百菌清降低了土壤健康状态，抑制了土壤微生物活性。短期试验内，百菌清并未影响土壤微生物群落结构，而在长期试验中，百菌清显著改变了土壤微生物结构组成。其中变形菌门Proteobacteria，芽单胞菌门Gemmatimonadetes和疣微菌门Verrucomicrobia最为敏感，分别下降了8.34%，3.38%和2.12 %。　　（3）本研究采用 15N同位素示踪技术来探究百菌清对土壤微生物反硝化的影响规律。结果表明，百菌清显著抑制了土壤硝酸盐和亚酸盐的还原过程，降低了土壤反硝化速率，但是促进了N2O的释放。周期结束后，空白组中硝酸盐和亚硝酸盐浓度为0.7mgkg-1和8.7mgkg-1，5 mgkg-1百菌清试验组中为3.9mgkg-1和16.0mgkg-1，10mgkg-1百菌清试验组为7.6mgkg-1和19.0mgkg-1，25 mgkg-1百菌清试验组为17.2 mg kg-1和31.7 mg kg-1。空白组中反硝化速率为14.44μmol 15N kg?1dry soil h?1，5 mgkg-1百菌清试验组中下降了27.08 %，10mgkg-1百菌清试验组中下降了53.12 %，25 mgkg-1百菌清试验组中下降了72.16 %。空白组中N2O释放量为0.21mgkg-1，5 mgkg-1百菌清试验组中提升了85.71%，10mgkg-1百菌清试验组中提升了185.71 %，25 mgkg-1百菌清试验组中提升了323.81 %。长期试验结果与短期试验趋势相同，但影响程度强于短期试验结果。　　（4）本研究采用呼吸抑制试验来阐明百菌清对土壤细菌和真菌反硝化过程中N2O释放的影响特征。结果表明，土壤细菌和真菌反硝化N2O释放的途径及各自的贡献比与百菌清的初始浓度有密切关系。在施用低浓度百菌清时（0 mg kg-1和5 mgkg-1），真菌反硝化释放的N2O占主导地位，贡献了55.24 %~72.74%；然而在高浓度百菌清累积时（10 mg kg-1和25 mg kg-1），细菌反硝化占主导地位，贡献了55.86 %~68.13%N2O释放。本研究还发现百菌清没有显著抑制真菌反硝化过程，但刺激了细菌反硝化N2O的释放，这表明百菌清主要是通过影响土壤细菌反硝化来调控N2O的释放。　　（5）反硝化酶活性试验及功能基因定量PCR技术表明，短期试验内百菌清显著抑制了4种关键的反硝化酶活性：硝酸盐还原酶活性（NAR）、亚硝酸盐还原酶（NIR）、一氧化氮还原酶（NOR）以及氧化亚氮还原酶（NOS）。空白组中，NAR、NIR、NOR和NOS活性分别为0.153、0.767、2.135、4.309μmol g?1h?1，25mgkg-1百菌清试验组为0.095、0.224、1.365、2.682μmol g?1h?1。然而，百菌清没有改变编译反硝化酶的功能基因丰度：narG、nirK、nirS、norB和nosZ。这表明百菌清短期抑制反硝化，促进N2O释放是通过影响反硝化酶活性，而不是直接改变基因丰度。在长期试验中，百菌清显著抑制了 4 种反硝化酶活性，且抑制程度强于短期试验，同时也下调了narG、nirS和norB丰度，但没有显著改变nosZ丰度。此外，研究结果还表明长期曝露百菌清下，N2O的释放由NOS活性控制，而非nosZ基因。　　（6）本研究结合微生物代谢及反硝化电子行为特征来探究百菌清对土壤反硝化过程的分子抑制机理。结果表明，微生物代谢过程中百菌清没有影响碳源葡萄糖的初始利用（葡萄糖→6 磷酸葡萄糖），也没有抑制催化该步骤的己糖激酶活性（0.075nmmg-1protein min-1~0.089nmmg-1protein min-1）。然而，百菌清显著抑制了糖酵解过程中最关键的步骤（磷酸甘油醛→磷酸甘油酸）。催化该步骤的磷酸甘油醛脱氢酶活性在空白组中为0.124nmmg-1protein min-1，5mgkg-1百菌清试验组为0.101nmmg-1protein min-1，10mgkg-1百菌清试验组为0.061nmmg-1protein min-1，25mgkg-1百菌清试验组为0.026nmmg-1protein min-1。此外，百菌清还显著抑降低了反硝化电子供体 NADH，能源物质 ATP 和丙酮酸的产生。空白组中NADH、ATP和丙酮酸含量为14.02μmol g?1、7.83μmol kg?1和21.06 μmol kg?1， 25mgkg-1百菌清试验组为3.12μmol g?1、1.11μmol kg?1和12.71μmol kg?1。本研究还发现百菌清对微生物电子转移系统活性（ETSA）影响显著，5、10和25 mg kg-1百菌清试验组中ETSA分别下降了21.93 %、36.84 %和44.74 %。上述结果表明，百菌清虽然没有影响碳源的初始降解，但显著抑制了微生物反硝化过程中电子产生和传递能力，进而恶化了土壤反硝化效能。　　（7）本研究采用结构方程模型来构建宏观过程与微观代谢之间的耦合关系，结果表明，微生物代谢过程中电子供体（NADH）和电子转移系统活性（ETSA）是通过先干预反硝化酶活性，进而间接影响土壤反硝化过程。此外，结构方程模型表明ETSA（间接影响系数为0.831）和NOS活性（直接影响系数0.628）是预测百菌清累积下土壤反硝化过程的关键因子。

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