首页> 中文学位 >动力蛋白Dynein通过调节自噬体逆行轴突转运相关蛋白改善APP/PS1双转基因小鼠认知障碍的实验研究
【6h】

动力蛋白Dynein通过调节自噬体逆行轴突转运相关蛋白改善APP/PS1双转基因小鼠认知障碍的实验研究

代理获取

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 实验细胞

1.1.3 质粒

1.1.4 病毒

1.1.5 主要试剂与耗材

1.1.6 主要试剂的配制方法

1.2 主要仪器设备

2.1 细胞分组

2.2 细胞培养及转染

2.2.1 细胞复苏

2.2.2 细胞换液

2.2.3 细胞传代

2.2.4 细胞冻存

2.2.5 细胞种板

2.2.6 细胞转染siRNA

2.3 动物分组

2.3.1 分组一

2.3.2 分组二

2.4 动物处理

2.4.1 小鼠繁殖及鼠尾基因型鉴定

2.4.2 海马立体定位注射AAVs

2.4.3 小鼠灌注、取脑

2.4.4 Morris水迷宫实验

2.5 免疫组织化学实验

2.6 免疫荧光实验

2.7 蛋白印迹实验

2.7.1 细胞总蛋白提取

2.7.2 组织总蛋白提取

2.7.3 BCA法测蛋白浓度

2.7.4 蛋白变性

2.7.5 SDS-PAGE电泳

2.7.6 蛋白转膜

2.7.7 封闭

2.7.8 免疫检测

2.7.9 ECL法显影

2.7.10 蛋白条带分析

2.8 实时定量PCR

2.8.1 目的引物序列

2.8.2 细胞总RNA提取

2.8.3 RNA反转录反应

2.8.4 实时荧光定量PCR反应

2.9 透射电镜观察海马区自噬现象

2.10 统计学处理

3 结果

3.1 APP/PS1双双转基因小鼠基因型鉴定并确定实验动物模型

3.2 APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力随年龄增加逐渐降低

3.3 APP/PS1双转基因小鼠的海马中不溶性Aβ沉积随年龄增加逐渐增多

3.4 APP/PS1双转基因小鼠海马中自噬体堆积且自噬水平升高

3.5 APP/PS1双转基因小鼠海马溶酶体功能受损

3.6 APP/PS1双转基因小鼠海马中逆行轴突转运分子马达动力蛋白中间链 DIC和 顺行轴突转运分子马达驱动蛋白 KIF5B蛋白表达量降低

3.7 APP/PS1 双转基因小鼠海马中逆行轴突转运相关蛋白 P150、P50、Rab7和ORP1L表达降低

3.8 筛选DIC基因干扰序列

3.9 AAVs感染效率的验证

3.10 DIC改善APP/PS1双转基因小鼠学习记忆功能

3.11 DIC减少APP/PS1双转基因小鼠海马不溶性Aβ沉积

3.12 DIC促进APP/PS1双转基因小鼠海马自噬体降解

3.13 DIC改善APP/PS1双转基因小鼠海马溶酶体功能

3.14 DIC 抑制 APP/PS1 双转基因小鼠海马顺行轴突转运分子马达KIF5B并增加逆行轴突转运相关蛋白P150、P50和Rab7的表达

4 讨论

DIC减少 APP/PS1双转基因小鼠海马不溶性 Aβ沉积并改善学习记忆功能

DIC减少APP/PS1双转基因小鼠海马轴突自噬体堆积

DIC改善APP/PS1双转基因小鼠海马溶酶体功能

DIC促进APP/PS1双转基因小鼠海马轴突转运相关蛋白的表达

参考文献

文献综述:动力蛋白Dynein与神经元自噬

致谢

攻读硕士研究生期间发表的学术论文目录

展开▼

摘要

目的:自噬是细胞内的一种保守的溶酶体降解途径,对于维持细胞稳态和适应外界刺激至关重要。但是由于神经元细胞的极化性,神经元自噬体的形成和降解具有空间分离的特点,致使轴突容易累积降解蛋白质和受损细胞器,从而容易导致许多神经退行性疾病,例如阿尔茨海默病(AD)。在AD发病早期可以观察到自噬体堆积在轴突末梢,产生自噬应激。在神经元中,动力蛋白 Dynein驱动着大分子物质沿着微管逆行运动,对神经元中物质的转运起着非常关键的作用。有研究发现,在 AD病人的大脑中动力蛋白中间链 DIC的表达降低,并且在AD小鼠大脑中 Dynein介导的逆行转运受损,自噬体沿着营养不良的神经突起大量累积。然而目前对于 AD 大脑中自噬体转运机制尚未十分明确,而动力蛋白 Dynein在自噬体轴突转运中的具体作用也知之甚少。因此,本研究拟通过 AD 体内模型APP/PS1 双转基因小鼠,动态观察不同年龄小鼠的认知功能、Aβ 沉积现象、自噬现象、溶酶体功能和轴突转运相关蛋白的变化情况;再通干扰和过表达动力蛋白中间链 DIC,进一步分析 DIC对 AD模型小鼠的认知功能、Aβ 沉积现象、自噬现象、溶酶体功能和轴突转运相关蛋白的影响。  方法:繁殖APP/PS1双转基因小鼠,将其分为Non Tg(C57 BL/6J 小鼠-6 月龄),Tg-3M(APPswe/PSEN1dE9 小鼠-3 月龄),Tg-6M(APPswe/PSEN1dE9小鼠-6月龄),Tg-9M(APPswe/PSEN 1dE9小鼠-9月龄),Tg-12M(APPswe/PSEN1dE9小鼠-12月龄)进行第一部分实验。首先水迷宫实验检测小鼠认知功能,免疫组化染色检测小鼠海马不溶性Aβ沉积情况;再运用透射电镜观察海马区域的自噬现象, Western Blot检测LC3和P62的蛋白表达水平;然后检测溶酶体标记蛋白 LAMP2和 CTSD(组织蛋白酶 D)的表达水平;进一步检测顺行/逆行轴突转运分子马达驱动蛋白 Kinesin/动力蛋白 Dynein的蛋白表达水平以及轴突转运相关辅助蛋白和衔接蛋白 P150、P50、Rab7和 ORP1L 的蛋白表达水平。在此基础上进一步利用 DIC 干扰/过表达腺相关病毒对Tg小鼠进行海马立体定位注射后再进行第二部分实验;在验证病毒干扰效率后,水迷宫实验检测小鼠认知功能,免疫组化检测小鼠海马不溶性Aβ沉积情况;Western Blot检测LC3和P62的蛋白表达水平;再检测溶酶体标记蛋白LAMP2和组织蛋白酶D 的表达水平;在此基础上进一步检测顺行/逆行轴突转运分子马达驱动蛋白 Kinesin/动力蛋白 Dynein 的蛋白表达水平以及轴突转运相关辅助蛋白和衔接蛋白P150、P50和Rab7的蛋白表达水平。  结果:水迷宫实验检测发现,定位航行实验中 APP/PS1 小鼠的平均逃避潜伏期均高于Non Tg小鼠,且随年龄增加而增加;空间探索实验中小鼠穿越平台的次数在 APP/PS1 小鼠中呈现减少的趋势,且随年龄增加而逐渐减少;免疫组化染色显示,Non Tg小鼠海马内未见不溶性Aβ沉积,Tg-3M小鼠海马开始出现Aβ沉积并随着年龄增加逐渐增多;电镜观察Non Tg小鼠及APP/PS1-3M小鼠海马区域未发现明显的自噬现象,但随着年龄增加APP/PS1 小鼠海马区域的自噬体呈现堆积状态;Western Blot检测LC3Ⅱ和P62的蛋白水平,发现APP/PS1小鼠的LC3Ⅱ和P62蛋白水平高于Non Tg小鼠,并随年龄增加呈现上升趋势;APP/PS1 小鼠DIC 和KIF5B蛋白水平均高于Non Tg小鼠,但随年龄增加而下降;APP/PS1小鼠海马中的P150、P50 、Rab7、ORP1L和LAMP2表达水平高于Non-Tg,但随年龄增加先上升后下降;组织蛋白酶D的表达则在Tg中逐渐降低。然后对AD小鼠进行DIC的干扰或过表达后进行后续实验发现,干扰DIC表达加重了AD小鼠认知障碍,促进了不溶性Aβ的沉积;过表达DIC则改善了AD小鼠的认知功能,减少不溶性Aβ的沉积;Western Blot发现,LC3的变化虽无统计学意义,但干扰 DIC后 P62增加,过表达 DIC后 P62减少;干扰 DIC后, DIC、P150、P50、LAMP2和CTSD的蛋白水平降低而驱动蛋白KIF5B增加,过表达DIC后DIC、P150、P50、LAMP2 和 CTSD 的蛋白水平明显增加而驱动蛋白KIF5B则降低;Rab7在干扰 DIC后反而增加,过表达 DIC后 Rab7水平增加程度更为明显。  结论:APP/PS1双转基因小鼠的学习认知功能障碍和不溶性 Aβ沉积随年龄增加逐渐加重,AD小鼠的海马中出现了明显的自噬体堆积,自噬降解受到阻碍,轴突转运相关蛋白表达降低,并且溶酶体功能受损;动力蛋白中间链 DIC 能够促进自噬体的轴突转运相关蛋白表达,改善溶酶体功能,降低自噬体的堆积,减少不溶性Aβ的沉积,从而改善AD小鼠认知障碍。由此可见,AD中动力蛋白Dynein对缓解自噬体堆积有着重要的意义,并有望为 AD 治疗提供新思路。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱:kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备:11010802029741号 ICP备案号:京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有
  • 客服微信

  • 服务号