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不同维生素A水平儿童肠道菌群对无菌小鼠肠粘膜屏障功能的影响

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英汉缩略语名词对照

前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 供体儿童血清维生素 A 水平检测

1.1.3 供体儿童粪便

1.1.4 主要试剂

1.1.5 主要仪器设备

1.1.6 主要溶液配制

1.2 方法

1.2.1 实验分组

1.2.2 制备粪菌移植菌液

1.2.3 粪菌移植方法

1.2.4 标本留取方法

1.2.5 小肠及结肠粘膜病理切片制作与观察

1.2.6 western blotting检测occludin、claudin-1蛋白的表达

1.2.7 提取小鼠PP结或肠系膜淋巴结(MLNs)中淋巴细胞方法

1.2.8 提取肠上皮间淋巴细胞及肠道黏膜固有层淋巴细胞方法

1.2.9 流式细胞术

1.2.10 肠道微生物信息学分析

1.2.11 16S rRNA PCR扩增及Miseq高通量测序

1.2.12 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况及体重

2.2 小鼠肠组织病理形态学观察

2.3 小鼠小肠组织紧密连接相关蛋白Occludin和Claudin-1的表达变化

2.4 小鼠血清DAO、血清IgA及盲肠粪便SIgA水平含量

2.5 小鼠脾脏及肠道黏膜相关免疫细胞比例的变化

2.5.1 肠系膜淋巴结(MLN)中B淋巴细胞比例

2.5.2 PP结中DCs比例变化

2.5.3 IELs和LPLs中T淋巴细胞亚群比例

2.5.4 脾脏Treg细胞及T淋巴细胞亚群的比较

2.6 Shannon-Wiener曲线和丰度等级曲线

2.7 物种Venn图分析

2.8 Alpha多样性指数

2.9 PCA分析及PLS-DA分析

2.10 分类学分析

3 讨论

全文总结

文献综述:胚胎期及生后早期胃肠道微生物群的定植

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文及参加的学术交流

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摘要

目的:分别将VAN、VAD儿童粪便移植入无菌小鼠体内,探索不同VA营养水平肠道菌群对无菌鼠肠道粘膜屏障功能的影响。  方法:收集重庆渝中区幼儿园血清视黄醇水平≥1.05μmol/L(VA充足)或<0.70μmol/L(VA缺乏)的健康儿童粪便,分别移植给四周龄Balb/c无菌小鼠后,构建VAN优势菌群作用小鼠组(VAN-FMT)及VAD优势菌群作用小鼠组(VAD-FMT)。28天后,HE染色观察小鼠小肠及结肠组织病理形态变化;Western blotting检测小鼠小肠组织紧密连接相关蛋白Occludin和Claudin-1的表达变化;ELISA检测小鼠血清DAO、IgA及盲肠粪便SIgA的含量;流式细胞仪检测Peyper Patch结中树突状细胞、肠系膜淋巴结中B细胞、上皮间淋巴细胞(IELs)、固有层T淋巴细胞、脾脏中Treg细胞及T细胞亚群的比例。16s rRNA测序技术对小鼠结肠粘膜菌群进行检测。  结果:实验期间各组小鼠一切正常,粪菌移植4周后各组间小鼠体重无统计学差异。HE染色发现VAN-FMT组小鼠的小肠及结肠粘膜发育均较VAD-FMT及无菌小鼠成熟,且VAD-FMT组小鼠结肠黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润。VAN-FMT小鼠小肠Occludin和Claudin-1的表达水平较VAD-FMT及无菌小鼠均明显升高(P<0.01,P<0.001),而VAD-FMT组仅Occludin蛋白表达水平较无菌小鼠明显增加(P<0.01)。VAN-FMT小鼠血清DAO水平显著低于VAD-FMT及无菌小鼠组。VAN-FMT小鼠粪便SIgA含量显著高于无菌对照小鼠(P<0.05),SIgA含量在VAD-FMT及无菌小鼠组间无统计学差异;血清IgA浓度在三组间无显著差异。  VAN-FMT小鼠MLN中B淋巴细胞的比例显著低于VAD-FMT组(P<0.05)及无菌小鼠(P<0.001),同时VAD-FMT组MLN中B淋巴细胞比例也明显低于无菌小鼠组(P<0.05)。VAN-FMT组小鼠PP结中DCs的比例显著高于VAD-FMT组(P<0.001)和无菌小鼠组(P<0.05),而VAD-FMT小鼠的 DCs比例却显著低于无菌小鼠(P<0.05)。三组小鼠肠上皮间淋巴细胞中CD8+TCRγδ+T淋巴细胞的百分比变化无统计学差异。小肠固有层中的CD4+T淋巴细胞的比例在VAN-FMT组(P<0.001)及VAD-FMT组(P<0.001)均显著高于无菌小鼠,但VAN-FMT与VAD-FMT两组间无统计学意义。LPLs中的CD8+T淋巴细胞的比例在三组间无显著性差异。同时发现VAN-FMT小鼠固有层中CD4+CD8+双阳性T淋巴细胞比例较VAD-FMT(P<0.05)及无菌小鼠(P<0.01)均显著增加,但后两组间无统计学差异。  16s rRNA测序分析结果显示, VAN-FMT及VAD-FMT小鼠结肠黏膜菌群组成具有很高的相似性,且两组的ACE、Chao、Shannon、Simpson多样性指数无统计学差异(P>0.05)。在门水平两组均以厚壁菌门及拟杆菌门为主,其中Proteobacteria在VAN-FMT小鼠显著增加  (P<0.05);在属水平,VAN-FMT组丰度最高的菌属为Bacteroides,其中Helicobacter(P=0.03)及Lachnospiraceae(P=0.005)显著性增加;而VAD-FMT组丰度最高的菌属为Staphylococcus。LEfSe分析显示VAN-FMT组有29个对分组有显著差异的物种,而VAD-FMT组有10个对分组有显著差异的物种。  结论:VAN儿童肠道菌群的粪菌移植可显著促进无菌小鼠的肠道发育成熟,上调肠上皮细胞间的紧密连接相关蛋白Occludin和Claudin-1的表达水平,增强小肠上皮屏障功能。同时VAN-FMT降低MLN中B淋巴细胞比例,诱导PP结中的树突状细胞成熟分化,促进B细胞从MLN向肠道归巢并分泌IgA,增加固有层中CD4+、CD4+CD8+T细胞比例,表明VAN儿童肠道菌群可能是通过其优势菌属Bacteroides诱导无菌鼠肠道天然粘膜免疫活性;而VAD儿童肠道菌群则以机会致病菌葡萄球菌属为主,且Prevotella增加,从而导致VAD-FMT小鼠肠道出现炎症,对无菌鼠肠道粘膜免疫调节作用减弱。

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