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C型流感病毒HEF蛋白乙酰酯酶活性位点鉴定及C型流感病毒和H10N8流感病毒对猪的致病性研究

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流行性感冒是由流感病毒引起的一种重要的人畜共患传染病，流感病毒的宿主范围很广泛，可以感染人和多种动物。近些年不断有新型流感病毒跨宿主传播感染人的报道以及新的流感疫情发生，特别是新发H7N9、H10N8和H5N6等流感病毒，对公共卫生安全构成了严重威胁。目前可以将流感病毒分为A型、B型、C型和D型，由于猪呼吸道上流感病毒受体分布的特性，使得猪在流感病毒生态学中扮演着重要的角色，被认为是流感病毒的“孵育器”。因此，对猪群中流感病毒进行长期监测具有重要的公共卫生学意义。本研究中研究了C型流感病毒和新发H10N8流感病毒对猪的致病性，阐明了猪在这两种流感病毒生态学中的地位，并鉴定了C型流感病毒HEF蛋白乙酰酯酶的活性位点以及 H10N8 流感病毒感染小鼠后肺脏的蛋白表达水平，为 C型流感病毒和H10N8流感病毒致病机制的研究奠定基础。　　首先，研究了C型流感病毒HEF蛋白乙酰酯酶的活性位点，当HEF蛋白Ser71、Asp366和His369分别突变为Ala后，突变病毒在细胞上的复制能力显著降低。随后，用神经氨酸酶处理突变病毒以促进病毒粒子的释放，发现神经氨酸酶处理后突变病毒的病毒滴度显著高于未处理组，而对野毒没有明显的影响。说明 Ser71、Asp366 和His369三个位点突变后，抑制了病毒粒子从细胞表面的释放。用乙酰酯酶的底物pNPA直接测定突变病毒和野毒的乙酰酯酶活性，结果发现，突变病毒的乙酰脂酶活性与野毒相比显著降低。当Ser71、Asp366和His369分别突变为Ala后，突变病毒的乙酰酯酶活性相对于野毒分别下降了95.2%、88.0%和97.6%。以上结果表明，ICV HEF蛋白Ser71、Asp366和His369对乙酰酯酶活性具有决定性作用，是HEF蛋白乙酰脂酶活性的催化位点。　　为了揭示猪在ICV生态学中的地位，本研究首次对我国华南地区猪群展开ICV的流行病学调查，并进一步研究了 ICV对猪的致病性以及在猪之间的传播能力。血清学调查结果显示，从华南地区采集的2050份血清样品中共检测到54份ICV抗体阳性血清样品，血清阳性率为2.63%。阳性血清HI抗体滴度在1∶40～1∶160之间，HI抗体的几何平均滴度（GMT）为58.04（95% CI: 54.17～65.83），并且可以从阳性血清样品中检测到ICV的中和抗体。首次证实了我国华南地区猪群中存在有ICV的感染，并且存在有ICV和AIV混合感染的情况发生。ICV对猪的致病性研究结果表明， ICV可以感染猪，引起流感样临床症状，并且可以通过鼻拭子向体外持续排毒，排毒时间可持续到攻毒后第8 d。由于ICV复制的最适温度为33℃，只能在猪的气管中进行复制，引起气管较为严重的炎性细胞渗出，而不适合在肺脏中复制，所以未能在肺脏中检测到病毒滴度。ICV感染猪后第7 d即发生血清抗体转阳，感染后第14 d血清抗体滴度达到1∶160。虽然ICV可以直接感染猪，但传播实验结果表明，ICV不能在猪群之间进行传播。研究结果表明，除人以外，猪也可能是 ICV的另一个重要宿主。　　在我们对华南地区猪群中的流感病毒进行长期监测过程中，从采集的 2050 份血清样品中检测到8份血清样品呈H10N8抗体阳性，中和抗体滴度最高可达1∶640，说明猪群中也存在有H10N8自然感染猪的情况发生。但H10N8流感病毒对猪的致病性还未见报道，本研究中我们分别研究了禽源H10N8（GD-E1）和人源H10N8（JX346）对猪的致病性以及在猪之间的传播能力。结果表明，JX346感染猪后可引起流感样临床症状，并通过鼻拭子向外排毒，感染后第3 d，感染组的所有猪只均可检测到排毒。另外，病毒还可以在肺脏和气管内复制，引起肺脏严重的病理损伤，通过免疫组化也可以观察到肺脏有大量的病毒颗粒存在。值得注意的是虽然同居组没有从鼻拭子检测到排毒，但同居组中有一只猪的血清发生了转阳，说明JX346可以在猪群之间通过直接接触进行传播，但传播效率较低。禽源H10N8 GD-E1感染猪的结果表明，GD-E1对猪的感染能力有限，不能在猪体内有效的复制和排毒，仅能引起血清抗体转阳，也不能在猪群之间进行传播。这些结果表明，应对猪群中的 H10N8 流感病毒进行密切的监测，为H10N8流感病毒的防控提供预警。　　相关研究报道，禽源H10N8和人源H10N8对小鼠的致病性存在明显的差异，本研究中我们也发现了 GD-E1 和 JX346 对小鼠的致病性有明显的差异，为研究禽源H10N8和人源H10N8流感病毒对小鼠致病性差异的分子机制，我们通过差异蛋白质组学比较了二者感染小鼠后肺脏的蛋白表达水平。结果显示，与GD-E1感染组相比，从JX346感染组共鉴定到836个差异蛋白，其中上调蛋白569个，下调蛋白267个。这些差异蛋白显著富集的通路主要有免疫应答相关信号通路、疾病和代谢相关信号通路等。其中显著富集的与免疫应答相关的信号通路包括抗原处理和递呈信号通路、补体和血凝级联反应、吞噬、NOD-like受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用信号通路以及NF-κB信号通路和TNF信号通路等。而参与这些信号通路一些关键蛋白的差异表达，可能是造成JX346和GD-E1致病性差异的原因，比如抗原处理和递呈信号通路中的β-2m、MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子；补体激活过程中的C3和C4；细胞因子产生和生物学效应发挥过程中的STAT1、STAT2、OAS2、IFI4、STING、IFIH1、OASL1、RSAD2、IFIT1和IFIT3等；以及参与细胞凋亡过程的Casp8、BID和MCL1。我们选取的5个差异表达蛋白和11个差异表达蛋白的基因也均通过Western Blot和qPCR得到验证。本研究中鉴定到的差异表达蛋白可作为后续研究的重点，为H10N8流感病毒致病机制、病毒与宿主蛋白之间的相互作用以及药物靶标的筛选奠定基础。

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