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【6h】

20-羟基蜕皮酮调控BmEsr16表达的初步研究

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昆虫主要通过Toll和IMD这两个经典的信号转导途径来应答病原微生物的感染。近年来有报道表明无病原物感染时，20E也可以参与调控抗菌肽的合成，关于20E调控抗菌肽合成机制的报道有很多，但具体调控机制却尚不清楚。　　我们在前期研究中发现，家蚕蜕皮激素调控蛋白（Esr16）可以结合脂多糖（LPS）并诱导抗菌肽Moricin和Cecropin的表达，参与到先天免疫中。那么BmEsr16是否能被20E调控参与到家蚕的体液免疫中呢？　　基于这一问题，我们选择以鳞翅目昆虫家蚕为代表进行了初步研究，具体内容如下：(1) 研究自然发育状态下家蚕BmEsr16是否于20E的滴度水平存在协同关系；（2）外源20E分别处理家蚕活体、离体培养的脂肪体和中肠及家蚕BmN细胞后，用Western blot和RT-qPCR分别检测BmEsr16在蛋白和mRNA水平上的表达；（3）生物信息学分析BmEsr16的结构及启动子序列，寻找受20E调控的靶转录因子，并用双荧光素酶实验进行启动子活性检测。　　通过以上实验的研究，得到了以下结果:　　（1）生物信息学分析BmEsr16蛋白，发现BmEsr16蛋白存在一个与人Npc2蛋白类似的结构域，都属于ML蛋白超家族，且存在3个潜在的胆固醇或者脂质结合位点，暗示BmEsr16可能参与到家蚕的脂类结合及代谢中。　　（2）Western blot和RT-qPCR检测自然发育状态下家蚕脂肪体和中肠BmEsr16的表达，发现BmEsr16的转录表达活性与20E滴度水平呈现同样的趋势，在5龄2d至游走期（W）其表达量较低，随着20E滴度升高， BmEsr16在RNA和蛋白水平上皆上调表达。　　（3）向5龄4d的家蚕注射不同剂量的20E，取脂肪体和中肠进行Western blot和RT-qPCR检测发现， 10μg/头的20E注射家蚕12h后，脂肪体和中肠中BmEsr16的表达量会被显著上调。　　（4）用外源20E处理离体培养的家蚕脂肪体，当20E浓度为5μg/mL时，BmEsr16的转录表达量被显著上调。　　（5）用20E处理家蚕BmN细胞，20E初级应答因子E75A被显著上调表达，但是BmEsr16的转录表达没有显著变化。暗示只有在家蚕活体水平上，BmEsr16才能响应20E的诱导，提高其转录表达活性。　　（6）分析BmEsr16上游启动子区域，搜索到6个可能的受蜕皮激素调控的转录因子结合位点，分别是BR-C Z1（1个）、BR-C Z2（1个）、BR-C Z4（2个）、E74A（1个）、EIP74EF（1个）结合位点。PCR扩增获得全长启动子序列后，又通过重叠PCR技术克隆获得截短型及缺失型启动子，并将其克隆至荧光素酶载体pGL3-Basic上，获得含有全长型、截短型和突变型启动子的重组质粒。　　综上表明，20E处理家蚕活体和离体培养组织会引起BmEsr16表达量上调，为进一步研究20E与先天免疫的关系奠定基础。

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