西罗莫司对大鼠肾脏缺血再灌注损伤早期的保护及对肾小管上皮细胞修复的影响

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缺血再灌注损伤是实体器官移植不可避免的一个阶段，在肾移植中，因肾脏缺血再灌注损伤的存在，可显著增加肾移植术后急性排斥反应发生率，同样肾小管上皮细胞的修复需要相对较长一段时间，从而导致肾移植术后移植肾功能延迟恢复，从长远考虑可能会影响移植肾和受者的长期存活。肾小管细胞培养模型、动物实验和临床研究均提示肾脏缺血再灌注损伤介导的肾小管上皮细胞死亡有坏死和凋亡两种形式。早期即出现大量肾小管上皮细胞凋亡和坏死，肾小管上皮细胞受累后主要发生去分化，细胞骨架的完整性和极性受到损害，最终导致肾组织结构破坏，从而影响肾功能。晚期在各种修复机制的作用下发生去分化的肾小管上皮细胞增殖、移行，并进行再分化，肾小管上皮细胞增殖的逐步启动后，经历一段时间后受损的部分肾功能逐渐恢复。作为实体器官移植与缺血再灌注损伤并存的现状，我们应采取积极有效手段和方法，最大程度上抑制肾小管上皮细胞的凋亡，减轻肾脏缺血再灌注损伤带来的不利影响，保护肾功能，对于减少肾移植术后移植肾功能延迟恢复以及急性排斥反应发生率，最终达到延长移植肾和受者的存活时间的目的，具有深远的临床意义。　　西罗莫司(SRL)是哺乳类SRL靶分子(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)抑制剂，动物实验和多年的临床应用结果均显示，以SRL为主而不含CNI的免疫抑制方案或将CNI类免疫抑制剂转换为以西罗莫司为主的免疫抑制方案后与以CNI为基础的免疫抑制方案相比，能显著降低因CNI类肾毒性造成的肾移植术后血肌酐呈爬行性上升的趋势，肾功能明显好转。因西罗莫司几乎无肾脏毒性，肝毒性较低，且与CNI类为基础的免疫抑制方案相比，患者的1年移植物存活率、急性排斥反应发生率均无明显差异，肾功能却明显优于CNI组。对肾移植术后血肌酐呈阶梯性、爬行性慢性上升的患者，并经病理确诊的因CNI类肾毒性和慢性移植肾病的患者，适时的进行SRL转换治疗可明显改善移植肾功能，延长移植肾和受者的存活时间。　　目前，关于SRL对缺血再灌注损伤的作用仍存在争议。研究发现SRL可能通过以下机制明显减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤和改善肾功能:(1)通过非直接通路激活T细胞凋亡程序，阻止了树突状细胞(DC)的抗原呈递，并进一步抑制其成熟;(2)减少细胞因子的分泌，阻止DC在肾组织迁移聚集;周四桂等用SRL处理经缺氧复氧的血管内皮细胞，通过抑制ROS、JNK、NF-κB的信号传导途径，抑制血管内皮细胞与中性粒细胞的粘附。YangB等发现使用SRL干预肾脏缺血再灌注损伤，主要是激活了24KDCaspase-3，减少凋亡的发生，同时减少远曲小管中Fas的表达，通过减轻Fas信号途径引起的免疫损伤，起到保护缺血肾脏再灌注损伤的作用。BohmovaR等在转基因高血压大鼠肾缺血再灌注损伤中观察发现，小剂量的SRL能够减轻由于肾素产生过多引起的肾脏再灌注损伤。但是也有一些学者持相反的观点，在体外，SRL在1ng/ml时抑制鼠的近曲小管细胞的增生，同时通过抑制肾小管细胞中70kDaS6蛋白激酶来发挥促进凋亡作用。在体内SRL通过抑制肾小管细胞再生和增加肾小管细胞的凋亡，抑制肾缺血再灌注后肾小管的再生，影响损伤的修复，从而延缓肾功能的恢复。LuiSL等报道SRL在1天、3天时降低增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，但是第7天时与对照组没有差别，表明SRL会加重肾脏的损害主要是通过抑制肾小管细胞的再生而延缓了肾功能的恢复，但并不是一直抑制肾小管细胞的再生。　　在缺血再灌注损伤中，不同剂量的SRL对不同时期大鼠肾缺血再灌注损伤及肾小管上皮细胞凋亡后增殖、修复作用尚不明确。我们推测，在缺血再灌注损伤早期，SRL的抗凋亡作用可能会抑制肾小管上皮细胞的坏死，起到对损伤肾脏组织的保护作用，但在后期随着肾小管上皮细胞修复程序的逐步启动，其抗增殖作用可能会抑制肾小管上皮细胞的细胞增殖、移行、再分化以及骨架的重建，进而影响肾功能恢复并存在剂量的依赖性和可逆性。我们研究发现给于大鼠SRL3mg/(kg.d)，其谷浓度为肾移植术后早期治疗浓度，以此剂量为标准我们建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，通过检测肾脏损伤敏感标志物NGAL、IL-18;凋亡基因Fas、Bcl-2和PCNA蛋白表达，肾小管上皮细胞修复因子HGF和BMP-7mRNA表达等方面，研究其对肾缺血再灌注损伤及肾小管上皮细胞修复的综合影响。　　第一部分:西罗莫司对大鼠肾脏缺血再灌注损伤早期的保护　　目的:探讨西罗莫司(SRL)对不同时期大鼠肾缺血再灌注损伤的影响。　　方法:　　1.选用雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠共90只，随机均匀分为五组:sham、I/R、UR+SRLlmg/(kg.d)、I/R+SRL3mg/(kg.d)、I/R+SRL5mg/(kg.d)。　　2.建立大鼠缺血再灌注损伤模型。　　3.药物各组术前3天及术后每日给予对应剂量SRLlmg、3mg、5mg与10ml生理盐水灌胃至各个观察日。　　4.sham、I/R给予等量生理盐水灌胃至各个观察日。　　5.术后1、3、7天每组各处死6只大鼠取全血及肾组织，检测血清肌酐、β2-MG;　　6.ELISA法测定中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、IL-18;　　7.HE染色评价组织病理学改变;　　8.免疫组化SABC法检测肾组织Fas、Bcl-2蛋白的表达;　　9.Westem-blot技术检测Fas、Bcl-2蛋白表达强度;　　10.脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测肾组织细胞凋亡率。　　结果:　　1.术后1、3天血Cr、β2-MG、IL-18、Fas和Bcl-2水平、病理学评分、Fas和Bcl-2蛋白阳性表达率、凋亡指数均升高，除Bcl-2水平外sham＜I/R+SRL5mg/(kg.d)＜I/R+SRL3mg/(kg.d)＜I/R+SRL1mg/(kg.d)＜I/R(P＜0.05)。　　2.Bcl-2水平:I/R+SRL5mg/(kg.d)＞I/R+SRL3mg/(kg.d)＞I/R+SRL1mg/(kg.d)＞I/R＞sham(P＜0.05)。　　3.术后7天Fas、Bcl-2水平:I/R+SRL5mg/(kg.d)与sham和I/R+SRL1mg/(kg.d)比较有差异(P＜0.05);　　4.NGAL水平术后1天高于sham(P＜0.05)。凋亡指数I/R+SRL5mg/(kg.d)与余四组比较有差异(P＜0.05)。　　结论:　　1.成功建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型。　　2.西罗莫司在缺血再灌注损伤早期通过其显著抑制肾小管上皮细胞细胞凋亡的作用，起到保护肾功能的作用。　　3.西罗莫司在缺血再灌注损伤早期对肾功能保护具有剂量依赖性。　　第二部分:西罗莫司对大鼠肾小管上皮细胞修复的影响　　目的:探讨西罗莫司(SRL)对不同时期大鼠肾小管上皮细胞修复的影响。　　方法:　　1.选用雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠共90只，随机均匀分为五组:sham、I/R、I/R+SRL1mg/(kg.d)、I/R+SRL3mg/(kg.d)、I/R+SRL5mg/(kg.d)。　　2.建立大鼠缺血再灌注损伤模型。　　3.药物各组术前3天及术后每日给予对应剂量SRL1mg、3mg、5mg与10ml生理盐水灌胃至各个观察日。;　　4.sham、I/R给予等量生理盐水灌胃至各个观察日。　　5.术后1、3、7天每组各处死6只大鼠取全血及肾组织，检测血清肌酐;　　6.ELISA法测定β2-MG、肝细胞生长因子(HGF)水平;　　7.HE染色评价组织病理学改变;　　8.免疫组化SABC法检测肾组织增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达;　　9.RT-PCR技术检测修复因子HGF的mRNA、骨形态发生蛋白-7（BMP-7）mRNA表达。　　结果:　　1.术后1、3天血Cr、β2-MG、病理学评分均升高:sham＜I/R+SRL5mg/(kg.d)＜I/R+SRL3mg/(kg.d)＜I/R+SRL1mg/(kg.d)＜I/R(P＜0.05);　　2.术后1、3天血HGF值、HGFmRNA、BMP-7mRNA水平和1、3、7天PCNA水平:sham＜I/R+SRL5mg/(kg.d)＜I/R+SRL3mg/(kg.d)＜I/R+SRL1mg/(kg.d)＜I/R(P＜0.05);　　3.Sham术后各时期均未见增殖细胞，余四组均有大量细胞增殖。　　结论:　　1.成功建立大鼠缺血再灌注损伤模型。　　2.西罗莫司在缺血再灌注损伤中其抗增殖作用阻碍了肾小管上皮细胞的移行、骨架重建等修复过程。　　3.西罗莫司在缺血再灌注损伤中其抗增殖作用具有剂量依赖性。

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作者
王志刚;
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作者单位

郑州大学;

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授予单位郑州大学;
学科泌尿外科(肾移植)
授予学位硕士
导师姓名丰贵文;
年度 2014
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原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类
关键词
西罗莫司,肾脏,缺血再灌注损伤,肾小管上皮细胞,功能修复;

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