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固氮施氏假单胞菌环二鸟苷酸(c-di-GMP)代谢相关基因的功能鉴定

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1文献综述

1.1 前言

1.2 c-di-GMP在微生物中的代谢

1.3胞内c-di-GMP的调控

1.4 c-di-GMP在微生物中的作用机制

1.5立题依据和技术路线

2材料与方法

2.1 实验材料

2.2 方法

2.3 数据库

2.4 应用软件

3结果分析

3.1 固氮施氏假单胞菌A1501基因组分析

3.2 SadC蛋白结构和序列分析

3.3 BifA蛋白结构和序列分析

3.4添加外源c-di-GMP对A1501生物膜形成的影响

3.5 sadC突变株和sadC过表达株的表型鉴定

3.6 bifA突变株和bifA功能回补株的表型鉴定

4讨论

5结论

参考文献

致谢

个人简历

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摘要

环二鸟苷酸（c-di-GMP）是一种广泛存在于细菌中的第二信使，参与调节多种生理功能，包括细胞分化、信号传递、生物膜形成、致病因子产生以及群体感应系统的调控等。c-di-GMP由两个GTP分子经环化酶（DGCs）合成，而被磷酸二酯酶（PDEs）降解。环化酶（GTPs）具有保守的GGDEF结构域，磷酸二酯酶（PDEs）具有保守的EAL结构域。在铜绿假单胞菌中sadC为c-di-GMP合成的关键基因，而bifA基因为c-di-GMP的降解基因，这两个基因分别参与了胞内c-di-GMP的浓度调节，进而影响菌体的运动、生物膜形成等表型。施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzei）A1501是一株根际联合固氮菌，c-di-GMP在该菌中的合成、降解机制还未得到鉴定。为研究A1501菌c-di-GMP的合成和降解途径及其对菌株的影响，本研究将A1501中与铜绿假单胞菌sadC和bifA高度同源的两个功能基因作为研究对象。通过构建sadC和bifA功能缺失突变株，测定突变株胞内的c-di-GMP浓度，进而分析c-di-GMP水平的变化对菌体运动、生物膜形成等生理功能的影响。取得的主要研究结果如下：
　　1、基因组分析表明，A1501中含有编码GGDEF结构域蛋白的基因共有33个，含有编码EAL结构域蛋白的基因有17个，其中编号为PST_3133的基因编码氨基酸序列中含有一个GGDEF结构域和一个EAL结构域，与铜绿假单胞菌BifA氨基酸序列同源性高达74％，将其命名为bifA。编号为PST_1148的基因编码包含一个GGDEF结构域的蛋白，与铜绿假单胞菌中已报道的c-di-GMP环化酶SadC同源性达到62%，将其命名为sadC基因。采用三亲结合的方法分别构建了bifA、sadC功能缺失突变株，以及sadC过表达株和突变株bifA的功能回补株进行后续研究。
　　2、对sadC突变株的胞内c-di-GMP含量及表型进行了测定，结果表明sadC的功能缺失对菌体胞内c-di-GMP含量与野生型相比没有明显差异，而且对菌株的生物膜形成能力以及固氮能力没有显著影响，但是菌体运动能力下降；透射电镜观察结果表明，sadC突变株与野生型的鞭毛形态没有明显差异。对sadC过表达菌株的生物膜形成能力进行测定，结果表明sadC过表达菌株的生物膜形成能力比野生型增强约2倍以上。通过测定sadC过表达株胞内c-di-GMP含量发现sadC过表达株胞内c-di-GMP含量与野生型相比，提高约140%，说明sadC参与了A1501菌体内的c-di-GMP合成途径。
　　3、测定bifA突变株的胞内c-di-GMP含量，结果发现与野生型相比bifA突变株胞内c-di-GMP含量增高约2倍以上；测定了bifA突变株的表型，结果显示，与野生型相比，bifA突变株的生物膜形成能力增强约2倍，而bifA突变株的功能回补株生物膜形成能力与野生型类似。由此推测，A1501菌中bifA基因可能是c-di-GMP的降解基因，该基因的功能缺失造成了菌体内c-di-GMP的积累，进而影响了菌体生物膜合成。表型测定也发现bifA的突变降低了菌体的运动能力。
　　4、通过qRT-PCR分析了bifA基因在菌体不同生长期的表达量，结果表明，bifA在野生型A1501的生长初期有较高的表达量，而在指数期及平台期表达量下降，暗示着bifA的表达水平可能与菌体浓度相关。通过添加不同浓度（0、10、20、40μM）的外源c-di-GMP考察对野生型生物膜形成的影响，结果发现外源c-di-GMP没有影响菌体生物膜的形成，推测外源c-di-GMP无法转运至胞内。
　　以上结果表明，在固氮施氏假单胞菌A1501中，c-di-GMP作为细胞重要的第二信使，参与调控菌体的生物膜、运动性等重要生理过程。

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