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PAMAM纳米转运体系在体内外基因转运及白血病基因治疗中的应用

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第一章材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞

1.1.2菌株和质粒载体

1.1.3试剂

1.1.4引物设计

1.1.5主要仪器

1.2实验方法

1.2.1质粒DNA的提取

1.2.2 PAMAM与DNA的结合试验

1.2.3 PAMAM对DNA的保护试验

1.2.4原子力显微镜检测

1.2.5 Zeta电位检测

1.2.6细胞活力测定(台盼蓝拒染法)

1.2.7细胞毒性试验(MTT)

1.2.8体外细胞吞噬实验

1.2.9体外报道基因转染试验

1.2.10 PAMAM/DNA在体内的分布及表达实验

1.2.11质粒DNA转染及荧光强度分析

1.2.12红细胞聚集试验

1.2.13血浆蛋白反应滤过试验

1.2.14白血病动物模型的建立

1.2.15外周血检测

1.2.16骨髓涂片检测

1.2.17过氧化物酶染色

1.2.18瑞氏染色

1.2.19观察小鼠存活状态和存活时间

1.2.20苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色

1.2.21组织免疫组化

1.2.22组织RT-PCR

第二章PAMAM纳米转运体系的构建

2.1 PAMAM纳米颗粒的制备

2.2 PAMAM结合DNA的能力

2.3 PAMAM对结合的DNA的保护能力

2.4 PAMAM与DNA不同质量比结合时的Zeta电位测定

2.5细胞生长曲线

2.6 PAMAM纳米转运体系的细胞毒性实验

第三章PAMAM的体外及体内基因转运效率评价及生物相容性分析

3.1 PAMAM的体外细胞吞噬实验

3.2 PAMAM介导的质粒DNA的体外转运实验

3.3 PAMAM/DNA复合物的体内细胞吞噬实验

3.4 PAMAM介导的质粒DNA体内转运试验

3.5在含有血清的培养基中PAMAM对质粒DNA转移能力的影响

3.6 PAMAM基因复合物对红细胞聚集的影响

3.7 PAMAM基因复合物与血浆蛋白的相互作用

第四章PAMAM作为基因载体对K562异体移植SCID小鼠白血病动物模型的治疗研究

4.1异体移植白血病动物模型的建立

4.2不同处理组白血病异体移植SCID小鼠外周血白细胞数量的比较

4.3 p16和LRRC4基因治疗对白血病异体移植SCID小鼠骨髓中原始粒细胞比例的影响

4.4 p16和LRRC4基因共同治疗对白血病细胞肝、脾组织浸润的影响

4.5 p16和LRRC4基因治疗对白血病异体移植SCID小鼠生存率的影响

4.6免疫组织化学分析p16和LRRC4在白血病异体移植SCID小鼠组织中的表达

4.7 K562细胞在白血病异体移植SCID小鼠中累及脏器的情况

第五章讨论

5.1基因载体的选择

5.2纳米颗粒的性质

5.3纳米基因转运体的优势

5.4 PAMAM的应用

5.5白血病的基因治疗

结论

参考文献

综述无机纳米颗粒作为基因转运体在医学上的应用

致谢

个人简历

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摘要

对疾病的预防和治疗来讲，基因治疗是一种有效和经济的方法。高效的基因转移和表达是基因治疗的关键技术。目前常用的基因载体包括病毒载体和非病毒载体，且临床试验中75％以上利用病毒为载体来转运目的基因。虽然病毒载体具有较高的转染效率，但同时也存在着很多难以克服的缺点，如具有免疫原性、细胞毒性、缺少组织特异性等等。因此对非病毒载体的研究受到人们的重视，而目前常用的非病毒载体，如多聚阳离子聚合物和脂质体，也存在着转染效率低，尤其在体内的转染效率低等缺点。因此寻找新的高效、安全、靶向的非病毒载体成为目前的研究热点。 随着纳米技术的兴起和发展，在纳米尺度内的物质的纳米特性引起了人们的关注。纳米颗粒一般是指尺寸在1～100 nm间的粒子，表现出强烈的尺寸依赖性、表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等特点，从而使其出现了许多不同于常规固体的新奇特性。由于纳米粒子表面原子数增多，表面原子配位数不足和高的表面能，使这些原子易与其它原子相结合而稳定下来，故方便在纳米颗粒的表面结合生物大分子，成为生物分子的高效载体。同时纳米颗粒的小粒径效应，使得它们可以有效的逃避脾滤过、延长血液循环时间、增强靶组织的累积，从而得以实现有效的基因转移。由于纳米颗粒作为基因转移载体具有如此众多的优越性，使其成为突破基因转移瓶颈最有希望的工具，是当今基因转移和纳米生物研究领域最热门的课题之一。目前研究较多的阳离子聚合物中发展最快的是树枝状聚合物(dendrimers)，其中又以聚酰胺一胺型树枝状聚合物(PAMAM dendrimers)研究的最为广泛。PAMAM作为基因载体具有很多优势，不会引起机体的免疫反应、无遗传毒性和细胞毒性、不会导致细胞的转化和细胞死亡、具有很高的基因转移效率、能介导外源基因在宿主细胞染色体DNA中的整合，从而获得转基因的长期、稳定表达，还可以保护转移基因不受机体血浆或组织细胞中各种补体以及各种酶的破坏，从而有利于目的基因在转移进入靶细胞后能更好、更稳定的发挥作用。因此PAMAM作为基因载体具有广阔的应用前景。 【PAMAM纳米载体结合和保护DNA的能力】 本研究项目通过体内外实验验证了PAMAM dendrimers作为基因载体的可行性，并将其应用于白血病的基因治疗研究。首先制备水溶性的PAMAM dendrimers纳米颗粒，原子力显微镜检测显示PAMAM直径约8 nm±0.5 nm左右，分布均匀。作为基因载体，与DNA的结合能力是必备条件之一，应用凝胶阻滞实验和DNA共沉淀实验来评价PAMAM的DNA结合能力。结果显示，该纳米颗粒在pH 5～9时可以结合和保护DNA，但是在pH 3时就丧失了这种能力。因此PAMAM具有在生理条件下(pH 7.35～7.45)对DNA的结合和保护能力。Zeta电位测定说明PAMAM的DNA结合能力是基于一种电负性DNA磷酸骨架和PAMAM的正电性之间的静电结合。用MTT检测PAMAM、PAMAM/DNA复合物对不同细胞系COS7、SMF、K562和Jurkat细胞生长的影响，结果显示在质量比为2：1～4：1时形成的PAMAM/DNA复合物对细胞生长的影响很小，但质量比超过4：1时形成的复合物对细胞的生长有一定的影响。 【PAMAM基因转运体系的体内外研究】 以PAMAM为载体转染编码绿色荧光蛋白的报道基因pEGFP-C2到COS7细胞，直接在荧光显微镜下观察其转染效率，结果证实PAMAM可以有效的携带外源基因在细胞中分布并表达出目的蛋白。但是，荧光素酶分析结果显示PAMAM与目的DNA以不同比例结合时的转染效率不同，当PAMAM/DNA质量比为4：1时，转染效率达到最高。扫描电子显微镜下直观观察细胞对PAMAM/DNA复合物的吞噬，结果显示细胞可以高效吞噬PAMAM及其复合体，并在细胞的胞浆和胞核中广泛分布，但在胞浆中的分布比胞核中要多。 为观察携带外源质粒DNA的PAMAM在体内的分布状况，将PAMAM/EGFP-C2复合物从BALB/c小鼠尾静脉注射进入小鼠体内，在不同时间点处死小鼠，取其各组织器官用戊二醛固定，制备组织切片在扫描电子显微镜下观察PAMAM和PAMAM/DNA在体内的组织细胞分布。同时制备冰冻切片，直接在荧光显微镜下观察PAMAM携带DNA在体内的组织分布及表达。电镜检测显示，小鼠的肝、肾、肺、脾、胰、脑、淋巴结和骨髓中有较多的PAMAM及PAMAM/DNA复合物存在，而在肠、胃、心中分布较少或没有分布。 PAMAM可以在小鼠的肾小管中分布，说明PAMAM可以通过肾脏排泄，不会在体内蓄积。在小鼠的淋巴结和骨髓中也有。PAMAM的分布，说明PAMAM可以有效的到达造血器官。组织荧光检测结果显示，PAMAM/DNA复合物在小鼠的肝、肾、肺、脾中有很强的荧光表达，而在心、脑、胃、肠中未检测到明显的荧光信号。 【PAMAM基因转运体系对白血病基因治疗的研究】 PAMAM载体具备结合和保护DNA的能力、较高的转染效率、携带外源基因在体内组织的广泛分布和表达，为其作为基因载体进行基因治疗研究提供了实验基础。在肿瘤病理标本的获取、对治疗有直接意义的造血干/祖细胞的体外分离纯化、扩增以及骨髓移植等方面，白血病都有其在基因治疗领域中的独特优势，因而受到广大学者的重视，以期以白血病的基因治疗为突破口，开辟人类肿瘤治疗的新天地。p16基因是一个经典的抑癌基因，研究发现p16基因缺失在多种肿瘤的细胞株中存在，占已知肿瘤细胞株的30～50％，在白血病细胞株中占25～64％，说明p16基因异常与多种肿瘤有密切关系。LRRC4基因是我室克隆的基因，实验室前期工作发现LRRC4可能作为一个受体或受体激酶或粘附分子参与调控细胞因子或生长因子所介导的信号传导通路，参与神经系统的发育和肿瘤的形成。通过RT-PCR发现p16和LRRC4基因在K562细胞中的表达明显下调。为了明确其在体内对于引发慢性粒细胞性白血病的K562细胞是否具有治疗效果，构建了K562-SCID白血病模型，评价p16和LRRC4对于白血病基因治疗的效果，并为PAMAM作为基因载体用于体内实验提供了更加充分的实验依据。对SCID小鼠经尾静脉注射K562细胞的方式建立人慢性粒细胞性白血病细胞异体移植SCID小鼠白血病动物模型，以PAMAM为载体，携带目的治疗基因p16和LRRC4通过静脉注射治疗。结果表明PAMAM同时携带p16和LRRC4基因时能对白血病进行有效的治疗，降低外周血中原始粒细胞的比例；减轻白血病对肝、脾和骨髓的浸润转移；使白血病小鼠的存活率延长43％，其治疗效果明显。这些结果说明，PAMAM可以携带目的基因到达骨髓、肝脏、脾脏以及其他组织器官，并表达出相应的蛋白而发挥作用。LRRC4和p16基因的共同作用可以有效的抑制K562细胞在体内的增殖，从而减缓其诱导的慢性粒细胞性白血病的发生和发展。 综上所述，PAMAM具有基因载体的必要条件，包括在生理条件下结合和保护DNA；能在体内外被细胞吞噬，并在细胞的胞浆和胞核分布。结合报道基因系统证实了PAMAM可以将外源基因携带至肝、肾、肺、脾，并且在上述组织中表达出目的蛋白。本研究结合纳米技术和分子生物学技术，创新性的应用PAMAM作为载体，评价了其携带p16和LRRC4抑癌基因对白血病动物模型的治疗效果，充分利用了纳米颗粒的优势，为血液系统疾病的基因治疗提供了良好的实验基础。

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